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(1.广西农业科学院农产品加工研究所,广西南宁 530007; 2.广西农业科学院,中国农业科学院甘蔗研究中心,广西南宁 530007)

广西是国内最大的甘蔗种植区和产糖区,甘蔗与蔗糖产量均占全国60%左右[1]。甘蔗含糖量高,是我国主要的制糖原料,其糖分由蔗糖、果糖、葡萄糖三种主要成分构成,约占18%～20%[2]。在食品工业生产中,我国的甘蔗工业产品比较单一,主要用于制造蔗糖和直接食用。甘蔗不仅富含蔗糖,还含有丰富的维生素以及Fe、Ca、P、Mn、Zn等元素[3-4],具有独特的甘蔗清香,是酿造果酒的良好原料。

研究发现,直接利用甘蔗汁中蔗糖分可以发酵制成不同产品,如甘蔗朗姆酒[5]、甘蔗果酒[6-7]、甘蔗醋[8-9]等。果酒发酵过程中,酵母菌起关键作用,发酵能力的好坏、副产物的多少,直接影响酒精生产率的高低,间接影响产品的风味品质[10]。酵母菌种类不同,同种原料发酵其生理特性也存在差异,如生长曲线、产酒精能力等[11]。近年来,已有不少甘蔗汁发酵酵母筛选、工艺方面的研究[12-14],但有关酵母菌在甘蔗汁中的发酵特性等报道较少,多数集中于啤酒发酵的研究[15-17]。

本研究是在前期试验的基础上,筛选出三种不同商用活性干酵母,对新鲜甘蔗汁进行发酵,探讨三种酵母菌发酵作用甘蔗汁的生长曲线、凝聚性、发酵度、发酵力、酸化力和产酒精能力等酿酒特性,以期为甘蔗汁发酵制备甘蔗果酒的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘蔗 新台糖22号,新鲜全茎蔗,无腐烂霉变,由广西农业科学院甘蔗研究所提供;葡萄酒高活性干酵母、耐高温高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;发利干酵母 英联马利(北京)食品销售有限公司,均为市售;乙酸、乙酸钠、无水硫酸钙、EDTA-Na、葡萄糖 均为分析纯。

YZ220×300甘蔗压榨机 文山通用机械制造有限责任公司;摇床、高速离心机 上海博讯实业有限公司;BIC-300人工气候箱 上虞艾科仪器设备有限公司;JY6002型电子天平、JA2003型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;101-2AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;WJ-3A三孔独立控温水浴锅 常州伟嘉;pHS-3C酸度计 上海雷磁仪器厂;酒精计 北京克格仪器有限公司;PAL-1糖度计 日本ATAGO(爱拓)公司;Salvis LAB CN118恒温生物培养箱 瑞士Salvis公司;WU-CJ-FD洁净工作台 苏州苏杰净化设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘蔗汁和酵母培养液的制备 甘蔗汁:新鲜甘蔗经甘蔗压榨机二次压榨,混合均匀,120目过滤除杂得到甘蔗汁,备用。

酵母培养液:分别取葡萄酒高活性干酵母、耐高温高活性干酵母与发利干酵母三种酵母菌各0.050 g于100 mL无菌水中,置于180 r/min、30 ℃摇床培养10 h使之活化得到培养液,备用。

1.2.2 酵母生长曲线的测定 在无菌操作条件下,取171支无菌的50 mL试管分为A、B、C三组(各组57支待试试管),各组分别加入灭菌的甘蔗汁(含20%无菌水)20 mL,1 mL各种酵母培养液,摇匀后置于180 r/min,30 ℃的恒温摇床上培养,从0 h开始,每2 h取各组待试酵母培养液5 mL稀释10倍,在560 nm下测定OD560值,以未接种的甘蔗汁为校正比色计的零点,至培养36 h结束。每个测定值取3个平行点(即取3支待试试管)测定数据,取其平均值,根据OD值绘制酵母菌生长曲线。

1.2.3 酵母凝聚性的测定 酵母凝聚值采用光密度改良法测定[18]。取初始表观糖度为22 °Bx的甘蔗汁1500 mL,灭菌后分别加入葡萄酒高活性干酵母、耐高温高活性干酵母与发利干酵母三种酵母培养液,在温度25 ℃条件下静置发酵。每隔24 h取发酵液于离心机以8000 r/min常温下离心10 min,至发酵结束。沉淀即为酵母泥,收集为待用酵母泥。取待用酵母泥用20 mL EDTA-Na溶液(0.01 mol/L)洗涤1次后,于离心机以3500 r/min常温下离心10 min,弃去上清液,余下酵母泥再用50 mL去离子水洗涤、常温下离心2次(3500 r/min,10 min)后,收集酵母泥为备用酵母泥。称取1.0 g备用酵母泥,转移至50 mL带塞离心管中,加入乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5,0.2 mol/L)定容至50 mL,在振荡器上振荡5 min后,即刻取4.0 mL于670 nm分光光度计下测光密度OD值。同时将离心管静置于20 ℃水保温30 min,在距液面下1 cm处吸取4.0 mL于670 nm分光光度计下测定光密度OD1,以pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液为空白对照。

计算公式:酵母凝聚值F(%)=(OD-OD1)/OD×100

1.2.4 酵母发酵力的测定 酵母发酵力采用CO2失重法测定[19-20]。在专用发酵瓶中加入150 mL初始表观糖度为22 °Bx的甘蔗汁,分别加入3 mL各种酵母培养液,接种完毕后,盖上发酵栓,25 ℃下恒温静置发酵,称重发酵瓶。后每隔24 h称重一次,称重前先摇晃发酵瓶以排去发酵醪液中的CO2,直至CO2失重<0.2 g,发酵视为结束,以CO2失重为纵坐标,发酵时间为横坐标,绘制发酵速率曲线。

1.2.5 酵母发酵度的测定 在专用发酵瓶中加入150 mL初始表观糖度为22 °Bx的甘蔗汁,分别加入3 mL各种酵母培养液,接种完毕后,盖上发酵栓,恒温25 ℃下静置发酵10 d,酒精度无变化视为结束。取发酵液常温下离心(4000 r/min,15 min)后滤去酵母得到上清液。取50 mL上清液微火热蒸至原容积的1/3以便除去乙醇,添水恢复原容积后,冷却20 ℃下用糖度计测定糖浓度W1。同时用糖度计直接测定20 ℃下上清液的糖浓度W2。

按下列计算公式计算[21]:

真正发酵度:Wr(%)=(W-W1)×100%/W

外观发酵度:Wa(%)=(W-W2)×100%/W

式中:W-发酵液初始糖度(%);W1-发酵后排除酒精后的发酵液浓度(%);W2-发酵结束后直接用糖度计直接测定室温20 ℃下发酵液的糖度(%)。

1.2.6 酸化力的测定 采用酸化力AP值法测定酵母活力,参考文献[22]方法并稍作改进。取1.2.3待用酵母泥用4 ℃去离子水洗涤常温下离心(3500 r/min,10 min)3次,收集沉淀酵母泥备用。称取1.0 g沉淀酵母泥于100 mL器皿中,加入25 ℃蒸馏水50 mL,以150 r/min搅拌10 min,随后在酵母悬浮液中加入5 mL葡萄糖溶液(20.2%,w/v),持续搅拌至20 min时将pH计插到悬浮液中测定pH20,后每隔24 h测定一次,至发酵结束。

酸化力(Acidification power,AP)计算公式:AP=6.3-pH20(6.3为水的pH)。

1.2.7 产酒精能力的测定 采用蒸馏法测定[23]。取甘蔗汁,在初始表观糖度为22 °Bx、酵母添加量为0.5 g/L(质量浓度)、温度25 ℃条件下静置发酵,酒精度无变化视为结束。每隔24 h取100 mL发酵液于蒸馏瓶中,同时加入100 mL水,混合摇匀后进行蒸馏。当置冷凝管下端收集馏出液100 mL,停止蒸馏,摇匀备用。将酒精计和温度计缓慢置入蒸馏液中,测定温度和酒精度,查表校正为20 ℃时的酒精度。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2003进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 酵母菌的生长曲线

试验测定三种酵母菌的生长曲线,观察其生长状况。预实验结果发现,培养10 h后,测定的OD560值大于1.20,改进方法再次稀释10倍后,测定OD560值,其结果见图1。

由图1可以看出,0～4 h是三种酵母菌的延缓期,对数生长期为4～18 h,稳定期为18～28 h,28 h后酵母菌开始进入衰亡期。从酵母菌OD值变化可以看出，三种酵母菌生长曲线的趋势基本一致，其中，葡萄酒高活性干酵母在对数生长期和稳定期均表现良好。付满[24]研究采用安琪葡萄酒酵母进行蔗稍汁酿酒的结果也显示,延缓期内葡萄酒酵母的活性较大,能够快速适应甘蔗汁的营养成分快速起酵,有较好的启发性能,且最早达到对数增长末期。葡萄酒酵母表现出良好的发酵性能,发酵过程也较平缓,稳定期长,降糖平稳。本研究从OD值大小及酵母菌生长曲线的趋势,特别是在对数生长期和稳定期的变化趋势,可以看出三种酵母菌的生长稳定性为葡萄酒高活性干酵母>耐高温高活性干酵母>发利干酵母。

图1 不同酵母菌的生长曲线Fig.1 The growth curves of different yeasts

2.2 凝聚性的变化

酵母的凝聚性是酵母菌生理特征之一,每一酵母菌均有自身的特定的凝聚性。凝聚性强的酵母,发酵结束时沉降早、效率快,发酵缪液中酵母细胞数少,能大大降低酵母长时间悬浮于发酵液中造成自溶的趋势;凝聚性差的酵母,发酵结束时沉降晚、效率慢,酵母细胞仍悬浮于发酵液中,易造成酵母细胞自溶,酵母发酵泥回收量低,增加滤酒难度,给生产带来不便[25]。凝聚值(F值)表示酵母的凝聚程度,凝聚值大小不同,代表酵母的凝聚作用力也有差距,其中F<20%为非凝聚酵母,20%≤F≤80%为中凝聚酵母,F>80%为高凝聚酵母[26]。

三种酵母菌在甘蔗汁的凝聚值变化见图2。从图2可知，发酵48～96 h时,三种酵母菌的凝聚值变化较大,在第72 h时呈现增强的波峰,葡萄酒高活性干酵母的F值为22.11%,可能是因为发酵过程中酵母处于比较旺盛的生理状态,在一定程度上增强了凝聚性[27],而在其他发酵时间段酵母菌的凝聚性均为F<20%,当发酵时间≥96 h时,随着发酵时间的延长,酵母凝聚值逐渐降低,其凝聚作用也逐渐减弱。综合甘蔗汁的发酵过程变化来看,三种酵母的凝聚值F<20%,均为非凝聚性酵母。

图2 不同酵母菌在甘蔗汁中凝聚性的变化Fig.2 The change of coagulability of different yeasts in sugarcane juice

2.3 发酵力的变化

酵母菌发酵作用甘蔗汁产生酒精,与之同时还伴有CO2的生成,形成的CO2从发酵醪液中排出,使整个发酵醪液体系的重量不断减轻,直至发酵结束后保持重量不变[20]。根据发酵液失重的程度,可测定发酵速率的快慢。发酵力可反映出待筛选酵母的起酵时间、对甘蔗汁的适应性、发酵强度及发酵过程的动态变化[15]。三种酵母菌的发酵力变化见图3。

由图3可知,在发酵过程的前48 h,三种酵母菌的CO2失重量变化最大,说明这一阶段发酵速度快,酵母菌处于繁殖旺盛期,发酵能力强,其中发利干酵母的发酵速度慢于葡萄酒高活性干酵母和耐高温高活性干酵母;发酵72 h后三种酵母菌的发酵速度明显降低,发酵96 h后三种酵母菌发酵过程趋于平缓,发酵基本结束。姜加良[28]研究传统酿造糯米酒中酵母菌的发酵特性也表明,发酵的产物之一是CO2,试验中产生的气泡数量越多,气泡体积越大,酵母的发酵能力越强,酵母的发酵速率越快,酵母的发酵程度越彻底。从总趋势来看,三种酵母菌发酵前48 h阶段的起酵速度和发酵力有一定的差异,但在发酵72 h后时,三种酵母菌的发酵力是相当的。

图3 不同酵母菌对甘蔗汁的发酵力变化Fig.3 Change of fermentation ability of sugarcane juice with different yeasts

2.4 发酵度的变化

不同酿酒酵母的菌株在代谢过程中存在差异性,对可发酵性糖的利用程度也不同。三种酵母菌作用甘蔗汁后的发酵度变化如图4所示。从图4可知,三种酵母菌的真正发酵度都达到70%以上,但都低于各自的外观发酵度,这与张帅等[21]研究苹果皮中分离到的3种酵母菌的发酵性能结果相类似。这是因为外观发酵度测定时不考虑酒精、CO2对发酵的影响,是以糖度计实测外观残留浓度计算的,所以测得的发酵度值比真正发酵度要高。综合总体来看,三种酵母菌作用甘蔗汁中的发酵度高低顺序为:葡萄酒高活性干酵母>发利干酵母≥耐高温高活性干酵母,这也说明葡萄酒高活性干酵母对可发酵性糖利用率最高,发酵后得到的酒精度也会较高。

图4 不同酵母菌对甘蔗汁的发酵度变化Fig.4 Change of fermentation degree of sugar cane juice with different yeasts

2.5 酸化力的变化

酸化力(AP)法是在酵母悬液中加入葡萄糖前后测定pH的变化,这种变化与酵母活性及发酵性能有关。酵母活力AP值一般为0.15～3.0,AP值愈大,酵母活力愈强,健康强壮的酵母AP值≥2.5,活性较差的酵母AP值一般<1.5。通过测AP值的高低可以判定酵母活力的强弱,对酵母的发酵性能有较好的预测作用[29]。但此法中添加的是葡萄糖,相同活力的不同酵母菌株对葡萄糖的代谢能力不同[16]。三种酵母菌不同时间下的酸化力AP值结果见图5。

从图5可知,在发酵过程中,发酵1～3 d时,三种酵母菌的AP值降低幅度最大;3～6 d期间,AP值处于波动变化,发酵6～8 d时,AP值逐渐上升至平稳。从发酵开始到发酵结束AP值的变化是先降低再持续平缓后上升的过程。AP值降低主要是因为CO2的产生和H+的释放,此外产生的CO2和释放的H+作为细胞内能量被利用会使酵母的活力下降[30]。郭晓明等[31]比较了4种干酵母对香蕉果酒的发酵特性研究也认为,安琪葡萄酒干酵母优于其它干酵母,发酵过程中酒精度增加速度均较快,在高糖度条件下发酵能力最好。从三种酵母菌发酵后期的酸化力的大小来看,葡萄酒高活性干酵母优于耐高温高活性干酵母和发利干酵母。

图5 不同酵母菌的酸化能力比较Fig.5 Comparison of acidification ability of different yeast

2.6 产酒精能力的变化

甘蔗果酒生产中,酒精是酵母利用发酵性糖而产生的,因此把利用发酵性糖发酵生成酒精的能力作为衡量优良酵母的一项重要指标[12],不同酿酒酵母菌株对可发酵性糖的利用程度不同,最终会导致酒精生成率有较大差别[19]。由图6可知,三种酵母菌的产酒精能力均随着发酵时间的增加而增强,当发酵48～96 h时,葡萄酒高活性干酵母产酒精能力明显强于耐高温高活性干酵母和发利干酵母;当发酵时间>120 h时,三种酵母菌产酒精能力的趋势相当,当发酵>216 h时,酵母菌产酒精能力趋于平稳,发酵视为结束。郭晓明等[31]研究同时认为,在发酵过程中,不同干酵母发酵的发酵液酒精度呈现逐渐上升的趋势。因此，不同干酵母生成乙醇的速度各不相同,安琪葡萄酒干酵母酒精生产速度较快,发酵结束后酒精度较高。

图6 不同酵母产酒精能力的比较Fig.6 Comparison of ethanol production by different yeasts

本研究中,从各发酵阶段及总产酒精量来看,三种酵母菌最终产酒精的能力基本相当,其中葡萄酒高活性干酵母产酒精为12.2%vol,略优于耐高温高活性干酵母和发利干酵母(12.0%vol)。这也验证了2.4研究结果,葡萄酒高活性干酵母在代谢过程中对可发酵性糖的利用程度较高些,发酵后得到的酒精度也会相对较高些。付满[24]研究结果也验证了采用安琪葡萄酒酵母对蔗稍汁进行发酵酿酒,酒精得率高。

3 结论

通过研究探讨葡萄酒高活性干酵母、耐高温高活性干酵母和发利干酵母三种商业酵母菌对甘蔗汁发酵的酿酒特性分析得到,三种酵母菌作用甘蔗汁的发酵过程中,酵母菌生长曲线趋势基本一致,三种酵母的凝聚值F<20%,均为非凝聚性酵母。从OD值、AP值大小及酵母菌生长曲线来看,三种酵母菌的生长稳定性和酸化力大小顺序为葡萄酒高活性干酵母>耐高温高活性干酵母>发利干酵母。综合发酵度、发酵力和产酒精能力三个方面来看,三种酵母菌作用甘蔗汁的发酵强弱顺序为葡萄酒高活性干酵母>发利干酵母≥耐高温高活性干酵母。三种酵母菌的发酵力基本相当,最终产酒精的能力差距不大,其中葡萄酒高活性干酵母最终产酒精为12.2%vol,耐高温高活性干酵母和发利干酵母均为12.0%vol。综上，三种商用酵母菌作用甘蔗汁的发酵过程及其酿酒特性存在一定的差异,葡萄酒高活性干酵母略优于耐高温高活性干酵母、发利干酵母三种酵母菌。三个酵母菌发酵得到的甘蔗果酒酒精度基本相当,但如何选用适合酿制甘蔗果酒的优势菌种,下一步将分析不同酵母菌株发酵果酒香气成分,结合感官阈值以及感官分析评价的结果等,连同甘蔗果酒的营养品质、口感风味等因素进行综合考虑与评判。