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(宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211)

褐藻是古老的海洋植物类群,包含的物种繁多,分布领域极广[1]。褐藻的营养价值很高,很多褐藻可直接食用[2],如海带(Saccharinajaponica)、裙带菜(Undariapinnatifida)、羊栖菜(Sargassumfusiforme)等。马尾藻属(Sargassum)是褐藻门中最大的一个属,在我国被广泛利用[3]。目前,已经将褐藻作为食物、药材、动物饲料和制胶原料[2,4]。

褐藻的风味主要是由挥发性成分和非挥发性滋味成分组成,而挥发性风味成分对褐藻产品整体风味起重要作用,也是影响褐藻作为食品原料的重要因素[5]。褐藻中的挥发性成分种类较多,目前已经鉴定化合物主要有醛、醇、酯、烃类和含氮化合物等[6]。

挥发性物质的提取方法主要有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、固相微萃取法、超临界流体萃取法等[7-8]。溶剂提取法是采用低沸点有机溶剂进行提取的方法,水蒸气蒸馏法是一种将在水中溶解度不大的挥发性成分随水蒸气蒸馏提取的方法,超临界流体萃取法是利用超临界流体在超临界区与所具有的高渗透性、高扩散性和高溶解能力选择性萃取目标组分的方法[9]。固相微萃取法(Solid-phase Micro Extraction,SPME)是一种样品前处理新技术,具有无有机溶剂参与、所需样品量少、灵敏度高等特点,与气相色谱-质谱(GC-MS)联用可集成采样、萃取、进样等环节,大大提高了分析速度和灵敏度[10]。目前,国内外利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对多种海藻进行了挥发性成分的分析[11]。国内外对硅藻、红藻、绿藻等藻类中挥发性物质的研究较多[12-15],对褐藻中挥发性成分主要集中在海带、裙带菜等[16-17]。

羊栖菜(S.fusiforme)、铜藻(S.horneri)和鼠尾藻(S.thunbergii)是我国常见的经济马尾藻,作为暖温性海藻,目前在我国浙江省成功人工养殖,成为主要的海水养殖经济褐藻[18-20]。目前,有关羊栖菜、铜藻、鼠尾藻的研究多集中在良种与养殖技术、多样性与系统进化、代谢组学、生理生化与分子机制、生物活性成分研究等方面[21-25],而三种马尾藻中挥发性成分的对比研究国内外尚未见相关报道。本研究采用SPME技术分别提取羊栖菜、铜藻、鼠尾藻的分枝、叶状体、气囊三个部位,利用气相色谱-质谱联用进行三种马尾藻中不同部位的挥发性成分分析比较。采用Excel、Origin、SPSS、R语言等分析工具详细研究同一褐藻的不同部位中挥发性物质的种类和含量的差异、三种马尾藻之间挥发性物质的种类和含量的差异性,并对三种马尾藻的挥发性成分进行主成分分析,并绘制分布热图。通过本研究比较三种马尾藻中挥发性成分的差异性,为其进一步的开发利用,尤其在饵料营养学、食品应用等相关研究提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜铜藻、羊栖菜和鼠尾藻 采自温州洞头附近海域(2017年4月,采集后立刻置于-20 ℃冷冻保存);Tris-HCl(pH=8.0)缓冲液 北京索莱宝科技有限公司;香草醛标准品(纯度≥ 98%) 北京索莱宝科技有限公司;其它试剂 均为分析纯。

ML104/02电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Vocol色谱柱(60 m×0.32 mm,0.18 μm)、固相微萃取系统和萃取头(65 μm DVB/PDMS) 美国Supelco公司;15 mL SPME顶空萃取瓶 上海安谱实验科技股份有限公司;QP 2010nc气相色谱-质谱分析仪 日本Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 将新鲜铜藻、羊栖菜、鼠尾藻分别用蒸馏水反复冲洗干净,去除杂物及表面水分后,分别取三种马尾藻的分枝、叶状体、气囊三部位各15 g。参照宋悦等[13]的方法,并略加改进。每个样品取0.5 g,用液氮研磨成粉后,装入15 mL的顶空萃取瓶中,加入1 mL由Tris-HCl(pH=8.0)缓冲液和NaCl配制的缓冲溶液,再加入0.6 mg的香草醛标准品作为内标。萃取头在GC进样口老化30 min,40 ℃条件下萃取50 min,再于25 ℃室温下平衡20 min,取出萃取头立即插入210 ℃进样口,脱吸附5 min,进行GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS分析条件 GC条件:Vocol色谱柱(60 m×0.32 mm,0.18 μm);采用不分流进样模式,进样口温度210 ℃,载气为高纯氦气(99.999%),柱流速3.08 mL/min,分流比为4.5∶1,柱前压128.3 kPa,柱起始温度35 ℃,保持3.0 min,以3 ℃/min升至40 ℃,保持1 min,再以5 ℃/min,升至210 ℃,保持11 min。

MS条件:用电子轰击(Electron Impact,EI)源分析,电子能量为70 eV,离子源温度200 ℃,接口温度210 ℃,选取全程离子碎片扫描(SCAN)模式,质量扫描范围m/z为50～500,溶剂延迟0.6 min。

1.3 数据分析

1.3.1 定性分析 由GC-MS得到的谱图,经过标准质谱库NIST和WILEY的检索匹配,选取相似度不低于85%的物质进行分析,并结合已发表的文献,确定出挥发性风味成分。

1.3.2 定量分析 采用气相色谱面积归一法和内标法进行各挥发性组分的相对定量,并通过软件Excel 2016对所得数据进行汇总处理并分析误差,再将三种马尾藻不同部位数据分别导入SPSS 18.0软件进行单因素ANOVA分析。

1.3.3 主成分分析 将经软件Excel 2016处理所得数据导入R语言软件(The R Programming Language,version 3.2.3),利用Vegan程序包进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)并绘制PCA图,利用Pheatmap程序包绘制热图(Heat Map)。

2 结果与分析

将GC-MS检测得到的三种马尾藻不同部位的总离子流图(Total Ion Chromatogram,TIC)的原始数据整理后,导入软件Origin 8.0中,得到总离子流对比图(图1);经数据库检索与参考相关文献[17,20]进行定性,再经过定量分析,得到各种挥发性成分及其含量如表1所示。

表1 三种马尾藻的不同部位中挥发性成分及相对含量Table 1 The relative contents of volatile components in different parts of S.fusiforme,S.thunbergii and S.horneri

续表

图1 三种马尾藻不同部位挥发性成分总离子流对比图Fig.1 TIC profile of volatile components about different parts of S.fusiforme,S.thunbergii and S.horneri

在三种马尾藻的不同部位中共发现68种的挥发性组分,其中包含醛19种、醇11种、非芳香族烷烃10种、酯7种、烯烃7种、芳香烃5种、酮5种、醚1种、吡啶1种、胺1种、卤代烃1种。羊栖菜分枝、叶状体、气囊中分别鉴定出挥发性组分25种、17种和29种。铜藻分枝、叶状体、气囊中分别鉴定出挥发性组分32种、27种和31种。鼠尾藻分枝、叶状体和气囊中分别鉴定出挥发性组分19种、16种和12种。

三种马尾藻所含挥发性成分中多以醛类、非芳香性烷烃、醇类、酮类等为主。三种马尾藻均发现的挥发性组分共有10种,分别为苯甲醛、癸醛、正辛醛、壬醛、反-2-癸烯醛、十四烷、2-乙基己醇、β-紫罗兰酮、(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮和1,4-二甲苯。三种马尾藻各部位中均具有含量较高的壬醛、癸醛等饱和直链脂肪醛,此类成分通常具有蛤蜊味[26],在多种淡水鱼类中均被检测到[27],被认为是淡水鱼腥味的重要组成成分[28-29]。在三种马尾藻中均含有不饱和酮类组分(如(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮),这类物质通常能产生一些刺激性气味,起到一定增强腥味的作用[30-31]。在三种马尾藻中还发现多种烃类组分(包括烷烃、烯烃等),虽然这些物质没有气味或芳香阈值较高,对风味的贡献不大,但部分烃类在温度较高情况下会可能发生裂解反应,所得裂解产物可能与空气发生反应进而产生醛、酮、酯等影响风味的物质[5,29]。

三种马尾藻挥发性成分中差异性较大的组分有壬醛、苯甲醛、1-辛醇、苯乙烯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、反-2-癸烯醛,它们决定了不同马尾藻有着各自不同的风味。壬醛在铜藻三个部位中含量由高到低分别为气囊(353.70 μg/g)、分枝(187.89 μg/g)、叶状体(79.65 μg/g);在羊栖菜三个部位中含量由高到低分别为气囊(104.94 μg/g)、分枝(101.91 μg/g)、叶状体(18.90 μg/g);在鼠尾藻分枝、叶状体、气囊中含量分别为28.81、140.99和8.01 μg/g。1-辛醇在鼠尾藻分枝、叶状体、气囊中的含量分别为190.91、293.01和17.75 μg/g,在羊栖菜和铜藻中均未检测出。挥发性醇类一般具有柔和气味,但阈值比较高,除非以高含量存在,对藻类的风味也有贡献[16]。乙酸乙酯在铜藻分枝(446.60 μg/g)和气囊(795.86 μg/g)中均有分布,且含量高,在另外两种海藻中均未检测出。乙酸乙酯具有果香味,对腥味具有一定缓解作用[32]。

对比硅藻[12]和坛紫菜[13]中的挥发性物质可知,醛类(如壬醛、癸醛)、非芳香族烷烃(如十四烷)等挥发性成分在硅藻、坛紫菜和三种马尾藻中均有发现,推测是由于海洋藻类生存环境和生存方式的相似性而产生的共性挥发性物质。壬醛在红藻坛紫菜和条斑紫菜中质量分数分别为0.89%和3.07%[33],在红毛菜中质量分数为4.56%[8],在羊栖菜、铜藻和鼠尾藻的不同部位中质量分数均高于5.89%。壬醛在鲜海带中含量为0.89 μg/g[34],在羊栖菜、铜藻和鼠尾藻的不同部位中含量均高于8.01 μg/g。海参[35]中含有壬醛、癸醛、正辛醛等挥发性成分,在鲍鱼[36]中发现挥发性物质也含有壬醛、苯甲醛等成分,这些组分也在铜藻、羊栖菜、鼠尾藻中均有发现。推测这些挥发性物质可能是马尾藻的共有特征气味成分,它们对海参、鲍鱼的肉质风味形成和饵料藻的摄食优选可能发挥重要作用。

2.1 羊栖菜的不同部位中挥发性成分分析

羊栖菜分枝、叶状体、气囊中分别检测出挥发性组分25种、17种和29种,各组分的含量分析如图2所示。通过软件SPSS 18.0进行显著性分析发现,羊栖菜分枝各挥发性组分中壬醛、癸醛(73.04 μg/g)、十二烷(62.74 μg/g)以及1-戊烯-3-酮(64.46 μg/g)的含量均显著高于其余21种挥发性物质(p<0.05)。羊栖菜叶状体中7种醛类的含量水平差异性大,壬醛、反-2-癸烯醛(27.41 μg/g)均显著高于其它组分,癸醛(3.82 μg/g)、2-辛烯醛(4.45 μg/g)的含量显著低于其它醛类组分(p<0.05)。羊栖菜气囊中11种醛类组分的含量差异性大,其中正辛醛(8.34 μg/g)、(Z)-6-壬烯醛(6.75 μg/g)、反-2-辛烯醛(8.10 μg/g)含量水平最低,十一醛(15.06 μg/g)、2,4-癸二烯醛(15.42 μg/g)、2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛(13.81 μg/g)次之,壬醛含量显著高于其它醛类组分(p<0.05)。

图2 羊栖菜不同部位中挥发性组分及其含量Fig.2 Relative contents of volatile components in S.fusiforme注：横坐标数值为表1中挥发性物质编号，其仅代表各种挥发性成分。图3～图7同。

羊栖菜三个部位中检测出不饱和醛类,包括(Z)-6-壬烯醛、反-2-辛烯醛、2,4-癸二烯醛等。不饱和醛类大多具有令人愉悦的油脂香气,且阈值较低[37]。在分枝和气囊中均检测出高含量的饱和烷烃类物质(如十四烷、十二烷),这些物质在常温下无味道且结构比较稳定。同时,在分枝和气囊中均发现1-戊烯-3-酮的存在,而在叶状体中未能发现,其一般具有青叶芳香[38],会对各部位的整体风味产生有利影响。仅在羊栖菜叶状体中发现正三丁胺,含量为35.74 μg/g,在铜藻和鼠尾藻中均未发现;其具有刺激性气味[39],由于羊栖菜气囊和分枝居多,叶状体较少,所以其整体上对羊栖菜的风味影响较低。

2.2 铜藻不同部位中挥发性成分分析

铜藻分枝、叶状体、气囊中分别发现挥发性组分32种、27种和31种,各组分含量分析如图3所示。铜藻分枝中共发现醛类组分11种,总含量较高,在检测组分中占比为26.74%。通过显著性分析发现分枝中苯甲醛(111.94 μg/g)和癸醛(109.88 μg/g)的含量处于同一水平,显著低于壬醛(187.89 μg/g)含量,显著高于其它8种醛类成分,而其它8种醛类之间无显著性差异存在(p<0.05)。苯乙烯(366.94 μg/g)、乙酸乙酯、十五烷(243.74 μg/g)的含量显著高于其它挥发性组分(p<0.05)。铜藻叶状体中发现醛类组分12种。显著性差异分析发现,醛类组分中,反-2-戊烯醛和2,4-癸二烯醛含量显著低于其它挥发性组分(p<0.05)。十二烷和壬醛含量显著高于其它挥发性组分的含量(p<0.05)。铜藻气囊中发现醛类成分12种。通过显著性分析可知,壬醛的含量仍显著高于其它醛类组分(p<0.05)。壬醛(353.70 μg/g)、乙酸乙酯和苯乙烯(409.02 μg/g)的含量具有显著差异性,但均显著高于其它挥发性组分(p<0.05)。苯乙烯和乙酸乙酯均仅在气囊和分枝中发现,乙酸乙酯的含量在分枝和气囊中差异性大;而苯乙烯的含量在分枝和气囊中差异性小。

图3 铜藻不同部位中挥发性组分及其含量Fig.3 Relative contents of volatile components in S.horneri注：A.分枝；B.叶状体；C.气囊。

铜藻三个部位中,均含有反,顺-2,6-壬二烯醛、反-2-戊烯醛、2,4-癸二烯醛、(Z)-2-庚烯醛、(Z)-6-壬烯醛等多种不饱和脂肪醛类,其分布广、种类多、含量高,对铜藻的风味贡献大。在铜藻分枝和气囊中均有高含量的苯甲醛,而叶状体中苯甲醛含量仅为30.85 μg/g,显著低于分枝和气囊中的含量(p<0.05),其具有特殊的杏仁味[40],其会对铜藻的风味产生不良影响。同时,发现分枝和气囊中苯乙烯含量很大,其在一定条件下被氧化得到苯甲醛[41],这可能引起这两个部位中苯甲醛含量的上升。乙酸乙酯在分枝和气囊中均具有极高的含量,其能产生果香味[32],类似醚的味道,这对铜藻风味也存在一定的影响。

2.3 鼠尾藻不同部位中挥发性成分分析

鼠尾藻分枝、叶状体和气囊中分别发现挥发性组分19种、16种和12种,各组分的含量分析如图4所示。与羊栖菜和铜藻相比,鼠尾藻不同部位中挥发性组分种类少,未检测到酯类成分,各部位以醛类、酮类和醇类成分为主,1-辛醇是含量最高的组分,在分枝、叶状体和气囊中含量分别为190.91、293.01和17.75 μg/g;壬醛是含量最高的醛类组分,在分枝、叶状体和气囊中含量分别为28.81、140.99和8.01 μg/g。1-辛醇在鼠尾藻各部位中均有发现,且含量最高,显著高于其它组分(p<0.05),在羊栖菜和铜藻各种部位中均未发现。1-辛醇是鼠尾藻的特征性挥发物,具有一定的柔和花香气味[42],其可对腥味具有一定的缓解作用。通过显著性分析发现,叶状体中各种醛类组分之间都具有一定差异性,其中正辛醛(31.00 μg/g)和2-甲基苯甲醛(23.20 μg/g)含量最低,显著低于其它醛类组分的含量(p<0.05)。壬醛和1-辛醇(293.01 μg/g)均处于很高的含量水平,显著高于其它挥发性组分含量,且两者间也具有显著差异性(p<0.05)。鼠尾藻气囊中仅发现12种挥发性组分,其中醛类成分7种,总含量占鉴定出组分百分比为40.44%,壬醛含量仍显著高于其它醛类组分(p<0.05)。三个部位中均具有大量醛类物质,是造成鼠尾藻具有腥味的重要原因,但由于挥发性醇类物质对腥味具有缓解作用,导致鼠尾藻腥味相对没有铜藻重。(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮(21.51 μg/g)、2-十一酮(21.34 μg/g)、β-紫罗兰酮(15.81 μg/g)含量无显著性差异。

图4 鼠尾藻不同部位中挥发性组分及其相对含量Fig.4 Relative contents of volatile components in S.thunbergii注：A.分枝；B.叶状体；C.气囊。

2.4 三种马尾藻不同部位挥发性组分的比较

2.4.1 三种马尾藻中共有挥发性组分分析 结合表1和图5可知,三种马尾藻均发现的挥发性组分共有10种,分别为苯甲醛、2-乙基己醇、1,4-二甲苯、癸醛、正辛醛、壬醛、反-2-癸烯醛、十四烷、β-紫罗兰酮和(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮。鼠尾藻叶状体可发现这10种挥发性组分,分枝和气囊中均不足10种。铜藻不同部位中,10种挥发性组分的种类差异较低,且在分枝和气囊中分布情况相似。联系三种马尾藻中铜藻腥味最重这一现象,推测这10种挥发性成分的分布情况可能对马尾藻具有腥味有着重要影响。10种共有挥发性组分中,仅壬醛和苯甲醛在三种马尾藻的各部位均有发现。壬醛是三种马尾藻各部位中含量最高的醛类成分,其在羊栖菜分枝、叶状体和气囊中含量分别为101.91、18.90和104.94 μg/g,在铜藻以上三个部位中含量分别为187.89、79.65和353.70 μg/g,在鼠尾藻以上三个部位中含量分别为28.81、140.99和8.01 μg/g。壬醛在三种马尾藻气囊中的含量差异较大,在铜藻气囊中的含量最高。苯甲醛在铜藻分枝(111.94 μg/g)和气囊(126.43 μg/g)中含量较高,高于其在另两种马尾藻三个部位中的含量。推测这两种挥发性成分是三种马尾藻腥味表现出差异的重要因素。

图5 十种共有挥发性组分在三种马尾藻各部位中的相对含量Fig.5 Relative contents of 10 common volatile components in different parts of S.fusiforme,S.thunbergii and S.horneri

根据10种挥发性组分进行主成分(PCA)分析,由图6可知,羊栖菜叶状体、羊栖菜气囊、鼠尾藻气囊、鼠尾藻分枝、铜藻叶状体等五个部位聚类结果相似;而鼠尾藻叶状体、羊栖菜分枝、铜藻分枝、铜藻气囊这四个部位之间以及与其它部位间都有很大的差异性。由图5可知,PC1端,壬醛、苯甲醛、(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮、癸醛、十四烷等挥发性成分是聚类结果差异的主要贡献者,其中壬醛是最大的贡献者;PC2端,2-乙基己醇、β-紫罗兰酮、十四烷、(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮、苯甲醛等成分是影响聚类结果的主要挥发性物质,其中β-紫罗兰酮、2-乙基己醇是影响聚类的最主要两个贡献者。这证明10种共有挥发性成分中,壬醛和苯甲醛的含量高低是导致铜藻腥味比另两种马尾藻腥味更浓的重要因素。

图6 三种马尾藻各部位的主成分分析(PCA)图(10种挥发性组分)Fig.6 Principal component analysis of the different parts ofS.fusiforme,S.thunbergii and S.horneri according to the content of 10 common volatile components

2.4.2 三种马尾藻不同部位挥发性组分分布情况 将68种挥发性组分在三种马尾藻各部位的分布情况制作如图7所示的分布热图,其展现了各种挥发性物质的分布情况、聚类关系和三种马尾藻不同部位的聚类关系。壬醛在三种马尾藻各部位中含量均较高,1-辛醇在鼠尾藻各部位中均占据优势,其含量在分枝、叶状体和气囊中所占百分比分别为39.00%、28.18%和33.34%,两种物质对聚类结果均有着重要影响。三种马尾藻分枝之间,主要在1-辛醇、十二烷与壬醛、1-戊烯-3-酮、癸醛与十四烷、1-戊烯-3酮与β-紫罗兰酮等挥发性组分的相对含量上有差异;三种马尾藻叶状体之间主要在1-辛醇、三正丁胺、反-2-癸烯醛、对二甲苯、β-紫罗兰酮、4-乙基环己醇和丁酸庚酯等挥发性组分的相对含量有差异;三种马尾藻气囊之间,主要在1-辛醇、十二烷、苯乙烯、乙酸乙酯、1-戊烯-3酮、β-紫罗兰酮等挥发性组分的相对含量有差异。结合PCA分析和热图分析结果,发现PCA聚类与热图分析结果相似度较高,这证实了这10种共有挥发性物质对三种马尾藻不同部位的风味具有一定影响。羊栖菜腥味比铜藻弱,可能是壬醛、苯甲醛、苯乙烯、乙酸乙酯、β-紫罗兰酮、2-乙基己醇等物质对其风味的贡献比对铜藻风味的贡献低所致。

图7 挥发性组分在三种马尾藻不同部位中的分布情况Fig.7 Distribution of volatile components in different parts of S.fusiforme,S.thunbergii and S.horneri注:颜色越深(数值越大)表示挥发性成分含量越高。

3 结论

本研究通过SPME-GC/MS方法对三种马尾藻的分枝、叶状体、气囊中的挥发性成分进行分析,共发现68种挥发性成分,醛类组分组成及其含量占据了很大的优势,壬醛、癸醛、苯甲醛等是三种马尾藻挥发性成分的主要构成物质,十四烷、十二烷等烷烃类是含量仅次于醛类的挥发性成分。三种马尾藻中检测出10种共有成分,包括壬醛、苯甲醛、癸醛、正辛醛、反-2-癸烯醛、十四烷、2-乙基己醇、β-紫罗兰酮、(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮和1,4-二甲苯。其中壬醛、苯甲醛、(5Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮、2-乙基己醇对三种马尾藻各部位的挥发性有着重要影响。

差异性较大的挥发性物质主要有壬醛、乙酸乙酯、苯乙烯、1-辛醇,它们决定了不同马尾藻有着各自不同的风味。其中,壬醛、乙酸乙酯和苯乙烯是造成铜藻分枝和气囊与其它两种马尾藻各部位产生差异性的主要因素;1-辛醇是鼠尾藻的特征风味物质,会造成鼠尾藻与其它两种马尾藻风味产生差异。

本研究结果对马尾藻脱腥技术研究提供参考和依据,对推动海洋贝类、鱼类等对褐藻选择性摄食的相关研究产生积极作用,对于深入研究褐藻作为养殖饲料的价值和以褐藻为食的海洋生物肉质风味的形成等有着重要意义。