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(1.浙江工商大学食品科学与生物工程学院,浙江杭州 310018; 2.浙江工商大学环境科学与工程学院,浙江杭州 310018)

作为“世界三大名虾”之一的中国对虾(Penaeuschinensis),又名东方对虾,中国明对虾。主要分布在我国黄、渤海海区,与其它种类的中国养殖虾相比,中国对虾分布最为广泛,在我国水产品出口中占有重要地位[1]。中国对虾不仅具有丰富的营养成分,而且滋味鲜美,其蛋白质成分比一般鱼类肌肉、牛肉、猪肉都高,是典型的高蛋白低脂肪类的食物[2];此外,它还含有丰富的不饱和脂肪酸,约占总脂肪的66.2%[3]。中国对虾的加工利用,主要是针对对虾仁,因此有效的利用头、皮、壳、尾、骨及残余的肉等下脚料,不仅可以使资源得到最大化的利用,还能避免下脚料所引起的环境污染问题[4-5];目前,在对虾下脚料的精加工方面,主要包括:提取蛋白质,几丁质,虾青素,矿物质,维生素等[6-7],还可用于生产虾酱[8-9]、虾黄粉、虾的风味料[10]等方面。

在酶作用下,把蛋白质分子切割成小肽、脂肪酸、氨基酸等小分子物质,可获得具有复杂体系的酶解液。利用蛋白酶酶解技术所获酶解液通常富含各种游离氨基酸,可用于增加调味品香味。该方法不仅反应条件温和,操作简单,且能有效避免对风味前体物质的破坏。徐坤华等[11]以碱性蛋白酶水解中华管鞭虾虾头制备酶解液,优化条件下,所得酶解液中游离氨基酸增加了57.49%,其中呈味氨基酸有明显增加。李冬梅等[12]比较研究了不同蛋白酶对制备中国对虾酶解液的影响,MRPs的感官评价显示,复合蛋白酶制得的酶解液在鲜味、持续感和醇厚味方面均比其他蛋白酶强。此外,相关酶解技术在萨拉米、羊肉风味基料及鱼肉蛋白的制备等方面也得到了广泛应用[13-16],尽管采用单一蛋白酶酶解制备风味料有一定的功效,但是由于蛋白酶对肽键具有专一性,利用单一蛋白酶水解物料时,往往会对物料的酶解度产生制约作用,不利于提高酶解液的风味;采用多种蛋白酶联合制备酶解液,因不同蛋白酶作用位点不同,所形成肽类物质的长度也存在差异,有助于形成浓郁的风味,多种蛋白酶联合酶解工艺在玉米多肽,马鹿茸降血糖肽以及鲫鱼酶解液等[17-18]制备研究中均取得较好的效果。在虾类酶解液制备中也有蛋白酶分步酶解[19-20]、复合酶解[21-22]相关文献报道。

本研究首先选用六种不同蛋白酶对中国对虾下脚料进行酶解,在总结六种酶的酶解反应特性基础上,筛选出较好的双酶分步酶解组合;采用响应面分析法对分步酶解工艺进行优化,并采用氨基酸含量变化及感官评定来评价酶解工艺。此酶解工艺可以为工业化大规模生产提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国对虾下脚料 浙江省舟山市;甲醛 分析纯,迈瑞化学试剂有限公司;胰蛋白酶(Trypsin) 1.5×105U·g-1食品级;中性蛋白酶(Dispase) 1.0×105U·g-1食品级;风味蛋白酶(Flavourzyme) 5.8×104U·g-1食品级;碱性蛋白酶(Alcalase) 2.8×104U·g-1食品级;木瓜蛋白酶(Papain) 2.3×104U·g-1食品级;胃蛋白酶(Pepsin) 2.9×105U·g-1食品级;均由诺维信(中国)生物技术有限公司提供。

HC700 打粉机 永康市天祺盛世工贸有限公司;Contfuge stratus高速冷冻离心机 美国Thermo公司;LGJ.15冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂;L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司;HH-2数显电热恒温水浴锅 国华电器有限公司;Delta320 DELTA320 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 中国对虾下脚料的前处理 将中国对虾下脚料先常温解冻然后加入等量的水混合,再倒入胶体磨粉碎直至虾浆中没有大的颗粒存在(打粉机,3000 r/min,2 min),最后在将其冷冻干燥(冷冻干燥机,-40 ℃,24 h),装入真空袋里留其备用。

1.2.2 酶的筛选 实验中分别选取胰蛋白酶(Trypsin)、中性蛋白酶(Dispase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、碱性蛋白酶(Alcalase)、木瓜蛋白酶(Papain)、胃蛋白酶(Pepsin)对虾粉进行酶解,并根据相应文献和各种酶的最适反应条件[23],选取出本实验中的反应条件,反应条件如下:料液比1∶9、蛋白酶用量(酶与底物质量比)2%、酶解时间3 h,初始pH和温度根据如图1所示的各种酶的最适pH和最适温度来确定,在此条件下通过水解程度和感官评价等方法来比较各种蛋白酶对中国对虾下脚料酶解的影响。

表1 各种蛋白酶的酶解反应特性Table 1 Specialties of several proteases during enzymolysis

1.2.3 复合酶组合的确定 选取上述风味蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行组合,组合形式如下:碱性蛋白+风味蛋白、中性蛋白+风味蛋白、碱性蛋白+中性蛋白、风味蛋白+碱性蛋白、风味蛋白+中性蛋白。并对虾粉进行酶解,酶解条件如下:料液比1∶9、蛋白酶用量(酶与底物质量比)2%、酶解时间3 h,初始pH和温度根据如图1所示的各种酶的最适pH和最适温度来确定,通过比较各复合酶对虾粉的水解度和酶解液的风味来确定本实验的复合酶。

图1 酶解温度、初始pH及风味蛋白酶用量对水解度的影响Fig.1 Effect of temperature,primary pH and Flavourzyme amount on DH of Penaeus Chinensis waste

1.2.4 酶解液的制备 第一步酶解工艺确定:料水比1∶9,碱性蛋白酶用量2.4%,酶解温度58 ℃,初始pH7.5,酶解时间3 h[23]。本文主要研究第二步酶解工艺:第一步酶解结束后进行灭酶处理(即在沸水浴中对虾粉浆状物水浴加热10 min),在以风味蛋白酶继续水解并考察其单因素。具体实验步骤如下:称取一定量的虾粉,按一定料液比分散于蒸馏水中,调节初始pH,然后将样品置于恒温水浴锅中,在一定温度下加入酶进行酶解反应。恒温反应3 h后,将酶解物置于沸水浴中灭酶10 min。水解液在3000 r/min下离心10 min,取上清液用于水解度测定(Degree of hydrolysis,DH)。

1.2.5 单因素实验 分别以酶解液风味和水解度为指标,研究温度、初始pH、酶用量对水解度的影响。

1.2.5.1 研究温度对水解度的影响 分别选取40、45、50、55、60、65、70、75 ℃温度为实验条件,其它条件为:料液比1∶9、初始pH7、蛋白酶用量(酶与底物质量比)2%、酶解时间3 h。

1.2.5.2 研究初始pH对水解度的影响 分别选取5、5.5、6、6.5、7、7.5、8初始pH为实验条件,其它条件为:料液比1∶9、温度60 ℃、蛋白酶用量(酶与底物质量比)2%、酶解时间3 h。

1.2.5.3 研究酶用量对水解度的影响 分别选取0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%风味蛋白酶用量为实验条件,其它条件为:料液比1∶9、温度60 ℃、初始pH7、酶解时间3 h。

1.2.6 响应面试验 在单因素实验基础上利用响应面分析法优化第二步酶解工艺,以水解度为指标确定最佳酶解工艺。实验因素和水平设计如表2所示,分别以风味蛋白酶用量、初始pH和酶解温度为参考因素,水解度为响应值,采用三因素三水平设计法确定中国对虾下脚料最佳酶解工艺条件。

表2 实验设计中的因素水平及编码水平Table 2 Experimental range and factor levels for esterification process

1.2.7 水解度的计算 按国标GB/T 5009.39-2003采用甲醛电位滴定法测定酶解液中氨基态氮含量,并利用凯氏定氮法测定其中的总氮含量,以求得水解度[24-25]。

1.2.8 感官评定 将处理好的酶解产物放在65 ℃的水浴锅中保温,然后由20位评香人员用闻香纸蘸取酶解产物,并且将闻香纸浸入产物2～3 cm深,浸润1 min后取出,再将闻香纸放在离鼻2～3 cm的地方吸气,每次2～3次,评定标准见表3。

表3 虾粉酶解液的感官评定标准Table 3 Sensory evaluation standard of shrimp powder enzymolysis solution

1.3 数据统计分析

所有实验均为三次实验的平均值,误差为标准误差;采用Origin 8.0软件对数据进行处理和绘图;响应面设计软件(Version 6.0.5,Stat-Ease.Inc.,USA)对实验过程进行分析与优化。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶种类的确定

由于蛋白酶对肽键的专一性,不同酶进行酶解时常具有不同的酶解性能,具体结果见表4。由表4可见,在该酶解条件下,采用胰蛋白酶酶解中国对虾下脚料,所获产物的虾味较浓郁,无杂味,但是水解度相对较低;用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解时产物的虾味一般,有杂味,不能用以改善食品的风味,不予采用;风味蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶进行酶解时,不仅水解度相对较高,且水解产物的虾味浓郁,无杂味。因此,选取这三种水解度高、水解产物风味好的酶(风味蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶)作为研究对象,从中筛选出制备中国对虾酶解液的最佳酶解组合。

表4 各种蛋白酶的水解度与感官评定Table 4 Hydrolysis degree and sensory evaluation of various proteases

2.2 蛋白酶复合酶解组合的确定

内肽酶进行酶解时对疏水性或碱性残基的C末端多肽结合特异性较差,易形成小分子量的苦味肽;而外肽酶则可以有效切除此类疏水性氨基酸,使肽的苦味明显下降,从而改善酶解产物的滋味[26]。碱性蛋白酶和中性蛋白酶是内肽酶,风味蛋白酶是内、外肽酶,为了提高蛋白质利用率并改善酶解液的苦味,实验中选用双酶来酶解中国对虾下脚料,酶解效果见表5。由表可见,风味蛋白酶与碱性蛋白酶、中性蛋白酶的组合均比上述单酶水解中国对虾下脚料时的水解度高。将风味蛋白酶应用于第二步酶解中,虽然水解度略有降低,但能减少或掩盖内肽酶酶解所带来的苦味[27],且酶解液虾味醇厚,无腥味。因此,综合各种因素,选择碱性蛋白酶与风味蛋白酶组合作为中国对虾下脚料分步酶解时的较佳组合。

表5 不同酶组合分步酶解中国对虾下脚料酶解效果比较Table 5 Comparison of effects of Penaeus chinensis waste by the double-enzyme stepwise hydrolysis

2.3 风味蛋白酶酶解工艺条件优化

以风味蛋白酶作为本实验的酶解蛋白,考察温度、初始pH、风味蛋白酶用量对虾粉水解率的影响,结果如图1所示。由图1a可知,温度为40 ℃时,水解度最低,水解度为35%,这是由于在低温的状况下,酶的活性被抑制,导致水解度较低,当温度开始逐渐升高时,水解度逐渐变大,在60 ℃时达到最高,继续升高温度水解度迅速降低,这是由于温度过高导致酶失活以及被分解,从而影响酶解反应。综合以上分析,温度过低或过高都不利于酶解反应的进行,故选择酶解温度为60 ℃,此时水解度最大为53.5%。除了温度之外,酸碱度对酶的活性也有影响。

图1b为初始pH对水解度的影响。由图可见,在pH5.0～8.0范围内,pH为5时,水解度低,此时由于酸度低酶没有失活,但酶的活性被影响了,当pH继续变大,水解度升高,当pH达到6.5时,水解度最大,水解度为53.5%,继续增加初始pH,水解度迅速降低,这可能是由于pH对酶的活性部位以及酶与底物结合的影响导致酶活性在pH为6.5时,水解度最大。故最适初始pH设定为6.5。

由图1c可知,水解度随着风味蛋白酶用量的增加而增加,当酶用量为2.0%时水解度最大,此时酶与底物之间的浓度达到饱和,继续增加酶用量对酶水解蛋白质产生作用较小,且当酶用量达到一定值后过多酶的存在反而抑制酶的酶解活性,降低水解度,因此,2.0%作为最适酶用量。

2.4 响应面分析法优化风味蛋白酶酶解工艺条件

根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理[28],在单因素实验的基础上,利用响应面设计软件(Version 6.0.5,Stat-Ease.Inc.,USA)对中国对虾下脚料酶解工艺进行优化。试验方案及结果见表6,如表6所示,分别以X1、X2和X3为自变量,水解度为响应值(Y),其中实验1～12为析因试验,13～17为区域中心点5组重复试验,用以估计试验误差。

表6 响应面试验设计方案及实验结果Table 6 Design and results of response surface methodology

采用Design 7.0软件对表6中的数据进行多元回归拟合,获得回归方程为:

Y=+53.52+2.10X1-2.43X2-3.76X3-2.99X12-4.12X22-6.92X32+0.70X1X2-1.16X1X3+0.15X2X3

根据方差分析表7中的分析结果可得:所有的一次项及二次项都极显著,但是在三因素的交互作用中,X1与X2交互作用显著,X1与X3交互作用极其显著,X2与X3交互作用不显著;此外,该实验的精密度(Adeq precision)为39.35,说明该实验不仅合理而且精确度和可信度较高。

表7 模型回归系数显著性检验和结果Table 7 Significance test and results for regression coefficients of model

响应面分析图形是响应值与各因子所构成的一个三维空间曲面图和等高线图,可以从中看出各因素之间的相互影响并确定该实验的最佳条件。在响应面图中可以直观地看出加酶量、初始pH、酶解温度对水解度的影响,以及三因素间的交互关系对响应值的影响。

从图2a和图2d以及等高线的形状及疏密程度可知,加酶量与初始pH交互作用显著,且初始pH较酶用量对响应值的影响更大。同样,在图2b和图2e中,当酶用量保持在较佳水平(2.0%)时,沿着酶解温度升高方向的等高线密度更大,且水解度逐渐降低,说明与酶用量相比,酶解温度对水解度更为敏感,且与响应值呈负相关,此外由等高线的形状来看,两因素交互作用极为显著;对于图2c和图2f,从响应面三维图可知,初始pH与酶解温度间相互作用不显著,酶解温度比初始pH对水解度的影响更大,上述结果与表7方差分析相一致。

图2 各因素对水解度交互作用的响应面和等高图Fig.2 Responsive surface and contour plots for the effect of various factors on the degree of hydrolysis(DH)

通过响应面软件分析,对风味蛋白酶二次酶解中国对虾下脚料工艺进行了优化,结果显示:在料水比1∶9、风味蛋白酶用量2.19%、初始pH6.36、酶解温度58.6 ℃、酶解时间3 h条件下,中国对虾下脚料水解度为54.88%。为了实验操作便利,将上述最佳工艺条件进行修正:在料水比1∶9、风味蛋白酶用量2.2%、初始pH6.4、酶解温度59 ℃、酶解时间3 h的条件下,经3次重复实验,中国对虾下脚料水解度为54.79%±0.34%,实验值基本与理论预测值相一致,表明该回归方程可靠,能够反映上述三个因素对中国对虾下脚料水解度的影响。

2.5 酶解前后氨基酸含量的变化

游离氨基酸是水产动物呈味的基础物质和主要鲜味对象,结果如表8。由表8可见,双酶分步酶解中国对虾下脚料可以明显的增加酶解液中氨基酸含量。酶解液中总氨基酸含量达到33.6862 mg/mL,与原料相比总氨基酸含量大大提高。其中,酶解产物中呈鲜味的氨基酸谷氨酸,赖氨酸含量分别增加了10.93及6.95 mg/mL;酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸等呈苦味的氨基酸含量虽有增加,但相对而言,呈鲜味的氨基酸含量增加幅度更大,因此对虾下脚料经酶解后的鲜味强度得到了较大的提高。酶解液中除色氨酸之外,含有其余7种人体必需氨基酸,含量达到27.2543 mg/mL。因此双酶分步酶解中国对虾下脚料能明显的提高中国对虾下脚料酶解液的营养价值。

表8 酶解前后体系的游离氨基酸变化Table 8 Changes of free amino acids components before and after enzymatic hydrolysis

3 结论

为了获得具有浓郁虾风味的风味基料,提高中国对虾的整体价值及利用率,本研究通过复合酶解工艺,即在碱性蛋白酶初步水解中国对虾下脚料的基础上再采用风味蛋白酶对其进行酶解;研究表明:在料水比1∶9、风味蛋白酶用量2.2%、初始pH6.4、酶解温度59 ℃、酶解时间3 h。中国对虾下脚料水解度为54.79%,感官评价良好。酶解液中氨基酸含量为33.6862 mg/mL,其中必需氨基酸含量为27.2543 mg/mL,其中谷氨酸与赖氨酸含量大大增加,鲜味强度得到了极大的增强,可作为虾风味调味基料。