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(河南省生物技术开发中心,河南省植物天然产物开发工程技术研究中心,河南郑州 450002)

王不留行为石竹科植物麦蓝菜(Vaccariasegetalis(Neck)Garcke)的干燥成熟种子[1],中医临床常用中药,多以炒制入药[2-3],主要含有三萜皂苷、黄酮苷、环肽、类脂、脂肪酸和单糖等成分[4],具行血通经、催生下乳、消肿敛疮之功效[5]。

三萜类化合物具有较强的抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、降血糖、调控免疫等重要生物活性功能[6],而备受关注。相关研究表明王不留行总皂苷具有抑制新生血管的作用[7-13]。目前已分离得到了27个三萜皂苷[3],其母核结构均为五环三萜的齐墩果烷型或它的变形[14],药理活性研究表明,这些皂苷成分具有细胞毒活性和黄体细胞生长抑制作用[15-17]。因此,研究王不留行三萜皂苷提取工艺,对其药用开发与利用具有重要意义。目前只有洪奎等[18-19]利用正交设计法以总皂苷质量分数和干粉得率为综合评价指标考察了王不留行总皂苷的提取工艺,而未见其它关于优化王不留行总三萜提取工艺及其抑菌活性研究的报道。传统的正交试验方法虽然能够同时考虑几种影响因素,寻找最佳因素水平组合,却不能在给出的整个区域上找出因素和响应值间的明确的函数表达式,即回归模型,从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值[20]。

基于此,本实验采用单因素实验与Box-Behnken设计法对炒王不留行总三萜的超声辅助提取工艺进行优化研究,确定最佳工艺参数,并对所提取的总三萜进行了抑菌作用研究,以期为该植物资源的充分、合理开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

炒王不留行(FriedVaccariasegetalis) 河南郑州中草药批发市场,产地河北,由河南中医药大学生药学专家董诚明教授鉴定,为炒王不留行正品,置于50 ℃恒温干燥箱内烘干24 h后,粉碎过40目筛备用;大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 29213、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC 19615、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC 13311、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 49619,铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 27853,肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC 700603 以上7株实验菌株冻干菌种购自南京便诊生物科技有限公司;粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、都柏林沙门氏菌(Salmonelladublin) 以上3株实验菌株冻干菌种为河南省科学院天然产物重点实验室保存菌种;胰蛋白胨 上海宝录生物科技有限公司;牛肉浸膏 北京双旋微生物培养基制品厂;齐墩果酸标准品(批号121213,纯度≥98%) 成都普菲德生物技术有限公司;微量MIC测定板 美国Corning公司;无水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸 以上均为分析纯,购于北京化工厂。

ME-204型电子天平 美国Mettler公司;YJ-VS-2型超净工作台 无锡一净净化设备有限公司;SYQ-DSX-280B型手提式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;wi93008型麦氏比浊仪 北京东西仪科技有限公司;DHP-9082型电热恒温培养箱 上海红华仪器有限公司;KQ-500E型超声波清洗仪(功率500 W,频率40 KHz) 昆山市超声仪器有限公司;114摇摆式四两装高速中药粉碎机 瑞安市永历制药机械有限公司;TU-1810型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;DHG-9055A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;EYELA N-1100型旋转蒸发仪 上海爱郎仪器有限公司;SHB-III型水循环式真空泵 郑州长城科工贸有限公司;XMTD-7000型恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 王不留行总三萜的制备 精密称取炒王不留行粗粉1.0 g,置于100 mL 锥形瓶中,按相应液料比加入设定体积分数的乙醇溶液,封口膜密封后置于超声波洗涤器中,按相应超声温度和超声时间进行提取(40 KHz频率固定),重复三次,滤液合并后浓缩定容,取适量测定三萜类化合物含量。

1.2.2 标准曲线的制定 以齐墩果酸为标准品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法测定总三萜含量,参照刘晓艳等[21]方法略有改动。精密称取干燥至恒重的齐敦果酸标准品4.0 mg,置入10 mL容量瓶,加入甲醇定容至刻度,即得0.4 mg/mL的对照品溶液。精密吸取对照品溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL分别加入10 mL容量瓶中,60 ℃水浴挥干溶剂,然后加入0.4 mL新配制的5 g/100 mL香草醛-冰醋酸溶液和l mL高氯酸,摇匀后置于60 ℃水浴30 min,冷却至室温,加冰醋酸定容至10 mL摇匀,在550 nm波长处测定吸光值。以齐敦果酸质量x为横坐标,吸光度y为纵坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程:Y=2.8175x-0.0073,R2=0.9992。说明齐墩果酸标准品在0～0.02 mg/mL内线性关系良好。

1.2.3 王不留行总三萜含量及得率的测定 精密吸取各设定条件下提取的王不留行样品0.2 mL置于10 mL容量瓶中,按照1.2.2中的方法进行测定。根据标准曲线回归方程,由吸光度求出提取液中的总三萜质量浓度,并按照下式计算各处理的总三萜得率。

总三萜得率(%)=(总三萜质量浓度×提取液体积×稀释倍数)/炒王不留行粉末质量×100

1.2.4 单因素实验设计

1.2.4.1 乙醇浓度对王不留行总三萜得率的影响 在料液比 1∶20 (g/mL)、超声温度50 ℃、超声时间50 min的条件下,乙醇浓度分别为20%、40%、60%、80%、100%时,以总三萜得率为考核指标,考察乙醇浓度对王不留行总三萜得率的影响。

1.2.4.2 料液比对王不留行总三萜得率的影响 在乙醇浓度 60%、超声温度50 ℃、超声时间 50 min的条件下,料液比分别为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)时,以总三萜得率为考核指标,考察料液比对王不留行总三萜得率的影响。

1.2.4.3 超声温度对王不留行总三萜得率的影响 在乙醇浓度 60%、料液比 1∶25 (g/mL)、超声时间50 min的条件下,超声温度分别为30、40、50、60、70 ℃时,以总三萜得率为考核指标,考察提取温度对王不留行总三萜得率的影响。

1.2.4.4 超声时间对王不留行总三萜得率的影响 在乙醇浓度 60%、料液比 1∶25 (g/mL)、超声温度60 ℃的条件下,超声时间分别为20、40、60、80、100 min时,以总三萜得率为考核指标,考察料液比对王不留行总三萜得率的影响。

1.2.5 响应面优化试验设计 在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken试验设计原理,以乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)作为因素,以总三萜得率(Y)为考察值,设计4因素3水平的响应面试验分析优化王不留行总三萜提取工艺。试验设计因素水平见表 1。

表1 响应曲面实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.2.6 抑菌活性测定

1.2.6.1 王不留行总三萜药液母液配制 将王不留行总三萜提取物用乙醇-水(1∶1)作溶剂配制成浓度为80 mg/mL的母液。

1.2.6.2 菌株复苏及菌悬液的制备 将上述10种供试菌种进行斜面复苏,复苏后接种在固体培养基平板上,37 ℃培养12～24 h,将活化的细菌传种于液体培养基,37 ℃培养 16～18 h;再传种于液体培养基,增殖培养 2～6 h,用液体培养基稀释制成浓度为106～108CFU/mL的菌悬液,备用。

1.2.6.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用倍比稀释法[22]测定王不留行总三萜的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)。将1.2.6.1中制备的药液母液过0.22 μm滤膜,再用液体培养基依次倍比稀释9个浓度,即浓度依次为40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16 mg/mL。

将母液及稀释成不同浓度的药液依次加入微量MIC测定板中,每孔0.1 mL;再分别加入已稀释好的各种菌液,每孔0.1 mL。每种分别设置阳性对照(加入0.1 mL菌液和0.1 mL液体培养基)和阴性对照(只加液体培养基),制备好的微量MIC测定板于37 ℃恒温箱中培养24 h观察结果,完全没有细菌生长时的最低浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

1.2.6.4 最小杀菌浓度(MBC)的测定 取定量上述无细菌生长的各孔取样分别涂布于相应的无菌琼脂平板上,于37 ℃条件下培养24 h,观察结果,以平板上无细菌生长的最低药物浓度为MBC。

1.3 数据处理

单因素实验数据运用Origin 7.5软件绘制趋势曲线图;采用 Design-Expert 8.0.6 软件进行响应曲面实验设计、数据分析和二次模型的建立,通过对回归方程的解析以及响应曲面的分析获得最佳变量水平,通过F值考察(p<0.05)模型及因素的显著性。所有实验重复3次,取平均值。

2 结果与分析

2.1 炒王不留行总三萜提取单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对炒王不留行总三萜得率的影响 由图1可知,在乙醇浓度60%之前总三萜得率增加趋势比较明显,60%之后总三萜得率缓慢下降,这可能是由于乙醇浓度提高会使炒王不留行中一些醇溶性杂质、色素及亲脂性强的成分溶出量增加,从而影响炒王不留行总三萜的得率。因此,选择60%乙醇为最佳提取浓度。

图1 乙醇浓度对三萜得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on triterpenoids yield

2.1.2 料液比对炒王不留行总三萜得率的影响 由图2可知,随着料液比增加,炒王不留行总三萜的得率呈上升趋势;当料液比达到1∶25 (g/mL)时,总三萜得率达到最高;继续增大料液比,总三萜得率呈下降趋势。当溶剂量达到25倍时,炒王不留行中三萜类化合物基本完成从固相向溶剂相的转移,再提高溶剂量会使其他成分溶出增加,反而影响总三萜的提取,同时还会增加后续处理成本,因此,基于经济方面考虑,料液比1∶25 g/mL为宜。

图2 液料比对三萜得率的影响Fig.2 Effect of material/liquid ratio on triterpenoids yield

2.1.3 超声温度对炒王不留行总三萜得率的影响 由图3可知,随着超声温度的升高,总三萜得率不断增大,60 ℃时总三萜得率最高,超过此温度后总三萜得率下降,可能是由于温度过高对炒王不留行中三萜类化合物造成了一定程度的破坏,同时温度的加大也会增加杂质的溶出,影响总三萜测定,故选择超声温度在60 ℃。

图3 超声温度对三萜得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonication temperature on triterpenoids yield

2.1.4 超声时间对炒王不留行总三萜得率的影响 由图4可知,随着超声时间延长,总三萜得率先增大后降低,在40 min时达到最大。原因可能是随着超声时间的增加细胞破碎也增加,使得总三萜溶出更容易;达到一定时间时细胞基本破碎完成,继续延长超声时间,会使三萜发生一些转化反应,同时杂质溶出也会增加,反而降低了提取效果,故选择最佳超声时间为40 min。

图4 超声时间对三萜得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonication time on triterpenoids yield

2.2 响应曲面法优化炒王不留行三萜的提取工艺

2.2.1 响应面实验设计与结果 根据RSM的设计结果将乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)作为自变量,三萜得率作为响应值即因变量,设计4因素3水平响应面实验,共计29组试验点,其中5组中心试验点,每组试验做3次平行,响应面实验设计和实验结果见表2。

表2 响应面实验设计方案和实验结果Table 2 Matrix and experiments results of response surface methodology

2.2.2 模型的建立及其显著性检验 采用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合、得到炒王不留行总三萜得率(Y)对乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)的二次多项回归模型为:Y=1.2324+0.079333A+0.07425B+0.02925C+0.0775D+0.0595AB+5E-004AC+0.0335AD+0.03775BC+0.0455BD-0.0235CD-0.25674A2-0.24362B2-0.040367C2-0.069492D2。

对该模型方程进行方差分析和显著性检验,结果见表3。可见该回归方程模型极显著(p<0.0001);失拟项p=0.7874>0.05,表明失拟不显著,即该模型对本试验拟合程度良好;模型的相关系数R2=0.9754,校正决定系数RAdj2=0.9507,说明该模型能解释95.07%响应值的变化,即该模型与实际试验拟合程度良好,试验误差较小,预测相关系数PredR2为0.9009,说明该模型预测性良好,因此用该模型分析和预测炒王不留行中总三萜的得率是合适的。回归模型的一次项A、B、D极显著(p<0.01),C显著(p<0.05);二次项A2、B2极显著(p<0.01),C2、D2显著(p<0.05);交互项AB、BD、CD显著(p<0.05),其余均不显著,说明不同提取条件与炒王不留行总三萜得率之间不是简单的线性关系。影响炒王不留行总三萜得率由大到小的因素为A>D>B>C,即乙醇浓度>超声时间>料液比>超声温度。

表3 二次回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for each term of developed quadratic regression model

2.2.3 响应面交互作用分析 为确定乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)及其交互作用对炒王不留行总三萜得率的影响,根据回归方程绘出响应面图,如图5所示。

图5 各两因素交互作用对炒王不留行总三萜得率影响的响应面图Fig.5 Response surface of two factors interaction effects on the extraction of total triterpenoids from fried Vaccaria segetalis

由图5可知,响应面均为开口向下的凸形曲线,说明响应值存在极高值,6个图形的等高线中心均位于-1～1,表明炒王不留行总三萜提取最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。响应面坡度陡峭程度可以反映交互效应的强弱,响应面坡度越陡峭,表明响应值对于因素的改变越敏感,反之曲面越平缓表明因素的改变对于响应值的影响越小[23]。图5(a～f)直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响,乙醇浓度和液料比、液料比和超声时间、超声温度和超声时间交互作用曲面陡峭,表明其对炒王不留行总三萜得率的交互作用明显。分析图5a三维曲面图可以看出,乙醇浓度曲面比料液比曲面坡度陡峭,即固定其他因素不变,讨论乙醇浓度与料液比交互作用对炒王不留行总三萜得率影响大小,改变乙醇浓度对总三萜得率影响较料液比大。同理可对其它两因素交互作用的三维曲面图进行分析。

2.2.4 最佳条件的确定及验证实验 通过Design-Expert 8.0.6软件分析得到,超声辅助提取炒王不留行中总三萜化合物的最优提取工艺为:乙醇浓度64.6%、料液比1∶26.3 (g/mL)、超声温度63 ℃、超声时间41.3 min。考虑到实际操作的方便性,将最佳提取工艺参数修正为:乙醇浓度65%、料液比1∶25 (g/mL)、超声温度63 ℃、超声时间40 min。在此优化工艺下进行5次验证实验,实际测得的炒王不留行中总三萜得率为1.24%±0.003%,与理论预测值(1.28%)比较,其相对误差约为3.23%,说明基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠,对于超声辅助提取炒王不留行总三萜化合物的工艺有实际参考意义。

2.3 抑菌试验结果

由表4可知,炒王不留行总三萜化合物对所选10种常见致病菌的最小抑菌浓度(MIC)范围在1.25～20 mg/mL,尤其是对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和肺炎链球菌抑制作用最强。与其它中药如紫芝胞外三萜[24](对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌MIC均为 25 mg/mL)和赤芝菌体三萜[25](对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌MIC均为30 mg/mL)相比,炒王不留行总三萜的抑菌活性更强,并具有广谱性,对革兰氏阳性和阴性菌均有良好的抑制活性。因此,炒王不留行总三萜具有被研究开发成广谱抗菌剂的潜在应用价值。

表4 炒王不留行总三萜对10种常见致病菌MIC/MBC的测定结果Table 4 MIC/MBC(mg/mL)of 10 pathogenic bacteria by total triterpenoids from fried Vaccaria segetalis

3 讨论与结论

在单因素试验基础上,采用响应面法对炒王不留行总三萜的超声辅助提取工艺进行了优化,确定最佳提取工艺条件为:乙醇浓度65%、料液比1∶25 (g/mL)、超声温度63 ℃、超声时间40 min;在此条件下,炒王不留行总三萜得率为1.24%±0.003%,与模型预测的提取率误差较小,说明利用响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠。洪奎等[18-19]采用正交实验也对王不留行总皂苷的超声辅助提取工艺进行了优化,其最佳超声提取工艺为乙醇浓度70%、料液比1∶15 (g/mL)、超声功率640 W、超声时间40 min,在此最优条件下,干粉得率7.34%,总皂苷质量分数10.92,该正交最优工艺的提取效率远低于本实验,其原因除与王不留行的产地、采摘季节及炮制工艺等有关外,最主要原因是超声辅助提取的工艺条件不同所致,这说明响应面法能更好的反应了各因素之间的相互作用,是比正交设计更好的一种优化方法。

本研究结果发现,炒王不留行总三萜提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌和嗜麦芽窄食单胞菌等5种受试菌种MIC在1.25～5 mg/mL,而粗提物最小抑菌浓度低于8 mg/mL时就被认为其有潜在的治疗价值[26],因此炒王不留行三萜类物质具有良好的抗菌开发价值。

本实验为研究炒王不留行总三萜的抑菌活性提供了一定的基础性实验依据,对王不留行资源的开发利用具有一定的指导意义。但有关炒王不留行总三萜体内抗菌活性评价和起主要抑菌作用的三萜化合物种类有待进一步研究。