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(曲靖师范学院化学与环境科学学院,云南曲靖 655011)

油脂是人体所需的七大营养素之一,含人体必需脂肪酸,热能较高,具有重要的生理功能。日光中有365 nm长波紫外光及少量254 nm中波紫外光。企业使用最多的荧光灯其光谱组成中包含了300～400 nm的紫外光波段[1]。有研究报道,500 nm以下的光对油脂氧化影响极大[2]。油脂或含油脂食品在加工、销售、贮藏等过程中难免会受到日光和荧光灯所产生的紫外光影响,导致氧化酸败,降低油脂及其制品的营养价值、感官质量和食用安全性。为防止油脂氧化,BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、TBHQ(特丁基对苯二酚)、PG(没食子酸丙酯)等合成酚类抗氧化剂被广泛应用到油脂工业中,但短波光对其抗氧化效果的影响缺乏相关的研究报道。

因此本实验选择天然抗氧化剂含量较低、稳定性较差、保质期相对较短[3],在餐饮、烘焙、家庭等领域广泛使用[4-7],而加工使用过程易受短波光照射的猪油(Lard)为对象(猪油中脂肪酸14∶0、16∶0、16∶1、18∶0、18∶1、18∶2、18∶3的含量分别为2.2%、25.9%、1.8%、14.6%、43.6%、8.3%、0.2%),研究不同波长(254、365 nm)紫外光照射时4种常用抗氧化剂的抗氧化效果,旨在探讨紫外光对添加抗氧化剂后油脂氧化酸败的影响,研究油脂及含油脂食品中使用抗氧化剂后,在加工、存储、销售、检测等受紫外光照射情况下相关指标的变化,也为开发抑制短波光照射油脂引起氧化酸败的抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪肥膘 曲靖某农贸市场购买;BHA 98%,阿拉丁试剂有限公司;BHT(AR) 99%,山东西亚化学股份有限公司;TBHQ 98%,山东西亚化学股份有限公司;PG(AR) 99%,山东西亚化学股份有限公司;1,1,3,3-四乙氧基丙烷 98%,成都贝斯特试剂有限公司;其它试剂 均为AR级。

AL204-IC电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;29SN-DP-501恒温培养箱 天津试验仪器厂;365 nm紫外灯、254 nm紫外灯 8 W/T5广东三雄极光照明股份有限公司;自制紫外光照装置 实验室自制。

1.2 实验方法

1.2.1 油样的制备 按参考文献[8-10]的方法适当修改。猪肥膘经绞肉机绞碎后,装于不锈钢锅中,放置在电炉上熬炼,温度控制在不超过160 ℃,过滤油渣,静置沉降,取上层清油备用。取备用猪油加热熔化后混匀,分别称取400 g到口径为9 cm同一批次生产的5个500 mL的烧杯中(确保光照面积和与空气接触面积一致)。在3个盛有猪油的烧杯中分别加入浓度为0.04 g/mL的BHA、BHT、TBHQ乙酸乙酯溶液2 mL,1个加入浓度为0.02 g/mL的PG乙酸乙酯溶液2 mL,1个加入2 mL乙酸乙酯作为空白对照样。加热并搅拌到温度为85 ℃除去乙酸乙酯,得到符合GB 2760中规定的最大使用量(即BHA、BHT、TBHQ为0.2 g/kg,PG为0.1 g/kg)的试验油样和对照样。

1.2.2 紫外光法试验 为保证每份试验油样的光照时间和强度一致,所以设计光照装置为,在一个可以旋转的仪器台上放上直径约为25 cm的铁圆盘,再在铁圆盘中按“梅花状”放入5个盛有试验油样的烧杯,用无级调速电动搅拌机带动铁圆盘旋转,控制旋转速度为5～6 s/转。盛有油样的烧杯上方放置365 nm波长,8 W的紫外灯灯管,灯管到烧杯底部距离约为12 cm,开始光照时灯管与猪油表面距离为5 cm。照射一定时间后取样检测。每间隔约20 h取样一次检测。更换254 nm波长紫外灯同法进行光照试验。装置简图见图1。

图1 光照试验装置Fig.1 Illumination test device

1.2.3 检测项目及方法

1.2.3.1 过氧化值(POV) 按照GB/T5009.227-2016中第一法进行测定。

1.2.3.2 酸价 按照GB5009.229-2016中第三法进行测定。

1.2.3.3 丙二醛 按照GB5009.181-2016中第二法进行测定。试验得丙二醛回归方程Y=1.2217X+0.0028,R2=0.9990。(Y为吸光度,A;X为丙二醛浓度,μg/mL)。

1.2.3.4 共轭二烯类(K232)、共轭三烯类(K270)测定方法[11]准确称取 0.05～0.20 g油样于25 mL容量瓶中,加入正已烷溶解油样并稀释至刻度,将制备的溶液用1 cm石英比色皿,正己烷作空白对照,测定波长232、270 nm下的吸光度Ai,并按下式计算Ki值:

式中:Ki为共轭二烯或共轭三烯的相对含量;Ai为吸光度(波长为i=232 nm或270 nm);c为溶液的浓度,以g/100 mL溶液计;d为比色皿的长度,cm。

1.2.3.5 POV抑制率 参考文献[12-15]进行测定。

注：POVY1是油脂中添加抗氧化剂试验开始时的过氧化值;POVY2是油脂添加抗氧化剂并进行强制氧化一定时间后的过氧化值;POVK1是未加抗氧化剂油脂开始试验时的过氧化值,POVK2是未加抗氧化剂油脂进行强制氧化试验一定时间后的过氧化值。POV抑制率越大,说明抗氧化剂的抗氧化效果越好。

1.3 数据处理

过氧化值、酸价、丙二醛精密度按照标准要求,采用在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。

以空白样的试验结果作为对照,考查不同抗氧化剂抗氧化效果与空白样的组间差异性。采用Excel软件进行z检验,z检验所得的单侧p值越小,说明抗氧化剂的抗氧化性能越显著,即紫外光对抗氧化剂性能影响越小。

2 结果与分析

2.1 不同紫外光条件下4种抗氧化剂对猪油POV的影响

氢过氧化物的含量是评价油脂氧化程度的重要指标。光氧化是油脂自动氧化的关键和直接的诱因[16]。光线可以提高自由基的生成速度,引发自由基的链式反应,加速油脂的氧化,通常光波长越短,油脂氧化速度越快,其中紫外线作用最为强烈[17]。油脂的光氧化机制分为两类:Ⅰ类是在光的作用下,光敏剂吸收能量被激活,然后直接把油脂中的反应物活化成游离基,进而开始链氧化反应。Ⅱ类是光照后,基态氧(三重态氧3O2)在光敏剂的作用下激发成反应性极强的激发态氧(单重态氧1O2),直接进攻不饱和脂肪酸的双键,使双键发生位移并生成相应的氢过氧化物[18-19]。

从表1、表2的POV值及表3的POV抑制率比较可知,在试验时间范围内,254 nm光照下,4种抗氧化剂抑制过氧化物的能力很弱,BHT基本没有抗氧化作用。并且随着照射时间的增加,POV抑制率下降,表明抑制过氧化值的能力逐渐减弱;365 nm光照下4种抗氧化剂抑制过氧化物的能力也明显较低,TBHQ略好于其它3种,194 h时POV抑制率值最大,为86.1%,BHA、BHT、PG的抗氧化效果基本相当,194 h时POV抑制率值最大,约为72～75%;POV抑制率对比可知,4种抗氧化剂受紫外光照时,254 nm光照射的影响明显大于365 nm光照射的影响。由此说明,4种抗氧化剂在猪油中抑制过氧化物的效果与受光照射的波长有关,波长越短,抑制过氧化物效果就越差。主要原因是,单重态(1O2)与酚型抗氧化剂的反应速度常数最高,为1×106m-1s-1,而与油酸酯及亚油酸酯的反应速度常数约为1×105m-1s-1,过氧自由基的传递反应速度常数约为1×104m-1s-1[20]。所以试验研究的4种酚型抗氧化剂能有效抑制自由基的传递,但不能淬灭单重态(1O2),抑制光氧化的进行。只有能有效淬灭单重态氧分子的淬灭剂,才能有效地抑制油脂的光氧化。有报道表明,维生素E、类胡萝卜素、酚类双萜能够产生酚氧基淬灭单线态氧,抑制光敏氧化物的生成,还可以释放活泼氢,与脂氧自由基或脂过氧化自由基结合,形成较稳定的生育酚游离基,使不饱和油脂免受自由基、单重态氧攻击,从而起到抗氧化效果[21-22]。

表1 254 nm紫外光照下猪油过氧化值的变化Table 1 The change of peroxidation value of lard under 254 nm UV light

表2 365 nm紫外光照下猪油过氧化值的变化Table 2 The change of peroxidation value of lard under 365 nm UV light

表3 不同紫外光照下过氧化值抑制率的变化(%)Table 3 The change of inhibition rate of peroxidation value under different UV light(%)

2.2 不同紫外光条件下4种抗氧化剂对猪油酸价的影响

油脂氧化的初级氢过氧化物产物非常不稳定,易分解为醛、酮、酸等,因此酸价也是评价油脂氧化变质程度的一个重要指标。由表4、表5可知,在试验范围内,254 nm光照的酸价上升速度明显大于365 nm光照的速度。有研究发现,大豆油被UV-365照射的酸价比VIS-450照射的酸价高,原因是UV-365光比VIS-450光能量高[23],说明波长越短,越容易导致酸价升高;表4数据表明,254 nm光照下4种抗氧化剂都没有起到抑制酸价的作用。添加BHT的酸价略大于空白对照样,这是因为,BHT苯环上4号位碳上有甲基,其结构与丙烯类似,甲基上的α-氢原子受δ,π-超共轭的影响比较活泼,在紫外光照射下,甲基易被氧化为羧酸基，导致酸价上升;表5数据表明,365 nm波长光照下,4种抗氧化剂抑制酸价的作用不显著(p>0.05)，说明没有起到抑制油脂酸价的作用。

表4 254 nm紫外光照下猪油酸价的变化Table 4 The change of acid value of lard under 254 nm UV light

表5 365 nm紫外光照下猪油酸价的变化Table 5 The change of acid value of lard under 365 nm UV light

2.3 不同紫外光条件下4种抗氧化剂对猪油丙二醛值的影响

油脂中不饱和脂肪酸氧化可以产生大量的短链和长链的不饱和醛和酮,其中2-烯醛和2,4-二烯醛的生成量较多[24]。二烯醛与两分子硫代巴比妥酸(TBA)在一定条件下发生反应,产物显红色,在532 nm波长下有特征性吸收,吸收强度和丙二醛等的浓度在一定范围内存在线性关系[25]。因此通过测定丙二醛的含量,可判断油脂氧化酸败的情况。由表6可知,254 nm波长光照下空白样与添加4种抗氧化剂的差异不显著(p>0.05),其中BHT的变化与基本空白一致,表明BHT没有抑制作用。由表7可知,365 nm波长光照下空白样与添加4种抗氧化剂的差异极显著(p<0.01),添加过4种抗氧化剂的丙二醛值随照射时间的延长,反而呈下降趋势,所以添加过BHA、BHT、TBHQ、PG的油脂在用丙二醛值评价光照油脂酸败时,要注意365 nm波长光照的影响。

表6 254 nm紫外光照下猪油丙二醛含量的变化Table 6 The change of content of malondialdehyde of lard under 254 nm UV light

表7 365 nm紫外光照下猪油丙二醛含量的变化Table 7 The change of content of malondialdehyde of lard under 365 nm UV light

2.4 不同紫外光条件下4种抗氧化剂对猪油Ki值的影响

油脂自动氧化会生成十八碳二烯氢过氧化物和共轭二烯产物,在232 nm处会产生明显的吸收峰,测定油脂K232,就可以衡量油脂初期自动氧化的程度。油脂自动氧化的二级氧化产物二烯酮类和共轭三烯类在270 nm 处有吸收峰,检测K270可判断油脂氧化产生二级氧化产物积累的多少。比较表8、表9中的K232、K270可知,254 nm紫外光照条件下,随时间延长导致的K232、K270增加速度大于365 nm紫外光照。254 nm紫外光照射下抑制共轭二烯类、二烯酮类、共轭三烯类的作用不显著(p>0.05),其变化趋势与POV的变化基本一致;365 nm光照射下TBHQ对二烯氢过氧化物和共轭二烯产物的抑制差异显著(p<0.05),其它的均不显著(p>0.05)。由此表明,油脂受到254、365 nm波长光照时，4种抗氧化剂抑制酸败生成共轭二烯、二烯酮类和共轭三烯类的作用很小。

表8 254 nm紫外光照下猪油在波长232、270 nm处的Ki值Table 8 The Ki at λ232 and λ270of lard irradiated by 254 nm UV light

表9 365 nm紫外光照猪油在波长232、270 nm处的Ki值Table 9 The Ki at λ232 and λ270of lard irradiated by 365 nm UV light

油脂的光氧化速度很快,一旦激发态氧(1O2)生成,反应速度是自动氧化的千倍,且只与油脂的双键数成正比,而与双键的位置和类型无关[26]。高能量的短波光还可直接氧化酚类抗氧化剂,使其降低抗氧化的作用。1O2可与烯丙基自由基作用,也可直接与C=C键作用，然后进行π键转移,生成烯丙基氢过氧化合物,引发自由基链反应。由于光氧化的机理不同,与自动氧化的区别主要在于其氧化速率和氧化产物的不同。BHA、BHT、TBHQ、PG等皆属于酚类抗氧化剂,易释放H·,自身在形成自由基后，由于氧原子上的单电子能与苯环上的大π电子云发生共轭效应,从而变的稳定,不再引发链式反应,起到了抗氧化作用。也有学者认为，BHT的抗氧化作用是由于其自身发生自动氧化而实现的,在一定条件下会发生转化。PG的抗氧化作用是吸收氧化产生的自由基,阻断自由基链锁反应起到抗氧化作用,同时因为 PG 苯环上酚羟基多于BHT,所以淬灭清除活性1O2的作用比BHT高[27]，与本实验结果一致。

在254、365 nm光照试验中,TBHQ抑制油脂过氧化物的效果相对另外3种好,但在抑制酸价方面则基本一样。与有研究报道的TBHQ是由于与油脂过氧化自由基作用,分子共轭大π键重新排列形成稳定的半醌式自由基结构,这种半醌式自由基不再具备夺取油脂氢原子所需的能量[28],从而对油脂过氧化值的升高有一定的抑制作用,但是对于酸价升高具有促进作用[29]的观点相仿。

有研究表明,多聚不饱和脂肪酸的氧化伴随着紫外吸收的增加,共轭二稀与共轭三烯分别在232、270 nm处有吸收峰,紫外吸收的增加与氧的吸收和氧化前期阶段过氧化物的含量成正比[30],与本文的结果基本一致。也有报道称,由于其他物质的生成,影响检测的峰值,使峰值钝化或偏移，另外由于不同油脂的特性,在光照下，两值均呈大幅波动上升,且重复性不高[31]，除了氧化早期阶段,吸光度的大小与氧化程度的相关性不太好[32],所以不建议将这2个值作为油脂氧化程度的评价指标。

3 结论

本实验结果表明,照射猪油的紫外光波长越短,导致的氧化酸败速度越快。254 nm波长紫外光会让BHA、TBHQ、PG基本失去抗氧化能力,BHT完全没有抗氧化作用。365 nm波长光线也会导致BHA、BHT、TBHQ、PG抗氧化能力明显下降。254、365 nm光照猪油时，POV与酸价的变化规律类似,用POV、酸价评价油脂氧化酸败程度是合理的。光强度对加入抗氧化剂油脂的影响及二烯醛类在365 nm光照下不稳定的原因有待进一步研究。高效、安全的天然抗氧化剂是食用油脂抗氧化研究的新趋势[33],研究开发能有效淬灭单重态氧分子,同时也能有效终止自由基链式反应的油脂抗氧化剂是解决光氧化问题的重要途径。