段智红,袁圣亮,吕应年,2,*,吴科锋,2

(1.广东海洋医药研究院,广东医科大学,广东湛江 524023; 2.广东天然药物研究与开发重点实验室,广东医科大学,广东湛江 524023)

海藻是一类重要的海洋生物资源,目前国际应用的海藻年工业产值达到50亿美元以上,其中90%用作人类食品补充物质[1]。可食性海藻能提供优良的多糖、蛋白质、脂肪酸、矿物质、微量元素等营养成分,成为沿海居民普遍食用的海洋风味食品来源,尤其在亚洲国家,包括中国、日本、韩国、泰国等,每年消费大量海藻类食品。我国是海藻消费大国,其中紫菜、龙须菜(也称海发菜)以及海带等大型可食用海藻年产量数以千吨计[2-3]。

可食用大型海藻不仅含有丰富的营养物质,还含有多种天然色素,按照藻体的外观颜色可把这些可食用海藻分为三类:红藻(Rhodophyta)、绿藻(Chlorophyta)和褐藻(Ochrophyta)。海藻中的天然色素主要包括叶绿素类(Chlorophyll)、胡萝卜素类(Carotenoids)以及藻胆蛋白类(藻红蛋白Phycoerythrin、藻蓝蛋白Phycocyanin)等有色成分[4-6]。其中叶绿素是海藻进行光合作用的主要色素,在海藻中含量丰富,具有多种生物功能。叶绿素作为海洋食品的功能性成分,研究其结构、含量、分布以及生理活性对于人类健康具有重要意义。

近年来,人们对叶绿素及其衍生物的化学成分、生物活性、测定方法、生物合成及临床应用等方面进行了大量研究[7-9],本文选取消费量居前的六种可食性大型海藻,包括红藻类海发菜(Gracilarialemaneiformis)和紫菜(Porphyra,Nori),褐藻类海带(Laminaria,Kombu)和裙带菜(Undaria,Wakame),以及绿藻类浒苔(Enteromorpha,Aonori)和石莼(Ulva,Sea lettuce),综述这些海藻中叶绿素及衍生物的分布、结构及活性,为我国海藻经济的发展提供参考。

1 海藻中叶绿素及其衍生物的种类和含量

海藻中的叶绿素在光合作用的光吸收中起核心作用,其吸收大部分的红光和紫光,并反射绿光,因此叶绿素自身呈现绿色。海藻中叶绿素衍生物的种类及含量和生长环境有关。海藻生长区域的海水温度、氮磷含量、光照强度、光照时间等因素会对海藻叶绿素及其衍生物产生影响[10]。江篱属海藻龙须菜在富氮环境中,会吸收过量的氮储存在体内,当环境中缺乏氮源时,体内的氮会慢慢释放出来,供应海藻生长及生理需求,此时龙须菜藻体内的色素含量下降,藻体出现“黄化”现象,光合同化效率下降[11],表明环境因素的改变会导致海藻的叶绿素含量发生改变,也从侧面反映出海藻中的叶绿素成分复杂多变。

由于可食性海藻的物质成分对人体健康有影响,准确分析海藻中化学成分含量及结构具有重要意义。现代化的分离纯化技术和仪器分析手段为检测海藻中的化学成分提供了技术保障。可食性海藻原料经有机溶剂提取分离、柱层析纯化得到各种叶绿素衍生物。叶绿素类衍生物的化学结构鉴定方法主要有高效液相色谱-飞行时间-质谱联用(HPLC-TOF-MS),考虑到检测化合物的极性,质谱检测的离子源采用电喷雾(ESI)和大气压化学电离源(APCI)。六种常见可食性大型海藻中的叶绿素及衍生物的化学结构已被鉴定,化合物种类和含量结果如表1[12-13]所示。

表1 可食性海藻的叶绿素及其衍生物种类及含量Table 1 Varieties and contents of chlorophyll and its derivatives in edible

2 海藻中叶绿素及其衍生物的结构及转化

叶绿素分子是由两部分组成的:核心部分是一个卟啉环(Porphyrin ring),其功能是光吸收;另一部分是一个很长的脂肪烃侧链,称为植醇(叶绿醇,Phytol),叶绿素用这种侧链插入到类囊体膜。与含铁的血红素基团不同的是,叶绿素卟啉环中含有一个镁原子。叶绿素分子通过卟啉环中单键和双键的改变来吸收可见光。镁原子居于卟啉环的中央,偏向于带正电荷,与其相联的氮原子则偏向于带负电荷,因而卟啉具有极性,是亲水的,可以与蛋白质结合。植醇是一个亲脂的脂肪链,它决定了叶绿素的脂溶性。自然界中的叶绿素根据分子母环骨架和支链的差别可分为叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素等,各种叶绿素之间的结构差别较小[14-15]。

海藻中叶绿素和其他高等植物中分离的叶绿素化学结构相同,为镁卟啉化合物,从六种大型海藻中分离鉴定的叶绿素衍生物主要骨架有叶绿素a、b、c1、c2和紫红素,基本骨架结构见图1。叶绿素衍生物的取代基结构见表2。

表2 海藻中叶绿素及其衍生物的化学结构Table 2 Chemical structure of chlorophyll and its derivatives in algae

图1 海藻中叶绿素基本结构Fig.1 Basic structure of chlorophyll in algae

叶绿素很不稳定,光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解,产生各种叶绿素衍生物[16]。叶绿素分子(Chlorophyll)在高温蒸汽或微波加热下,容易脱去酯基,生成焦叶绿素(Pyrochlorophyll);在酸性条件下,容易失去卟啉环中的镁生成脱镁叶绿素(Pheophytin);在碱性环境下发生水解,脱去植基,转变为脱植基叶绿素(Chlorophyllide);脱镁叶绿素遇碱性条件能进一步脱去植基,生成脱镁叶绿酸(Pheophorbide)。叶绿素分子的α-H位点在生理条件下易被羟基取代,生成羟基叶绿素的衍生物。叶绿素a衍生物在加热条件下发生异构化,形成叶绿素a′,而且在经过热烫、微波、蒸汽以及烘烤处理后,异构体叶绿素a′达到最大值,并且叶绿素b′比叶绿素a′更容易生成[17]。

叶绿素本身呈绿色,遇酸后卟啉环中的镁离子被氢离子置换,生成褐色的脱镁叶绿素,这是海藻制品色泽褐变的原因。叶绿素在碱性溶液中水解生成绿色水溶性的脱植基叶绿素,这项化学反应可应用于海藻制品护色工艺,用碱处理保持海藻的色泽鲜绿。

可见,叶绿素分子中的活性位点,如镁原子、酯键以及羰基的α-H在生理代谢过程中或提取分离的理化条件下容易断裂或失去,形成多种叶绿素的衍生物[18-19]。以叶绿素a为例,其在生理代谢或理化条件下可形成衍生物,叶绿素及衍生物的转化如图2。

图2 叶绿素及衍生物结构转化Fig.2 Chemical transformation of chlorophyll and its derivatives

3 叶绿素及其衍生物的生理活性

从海藻中提取分离的叶绿素类衍生物具有多种生理活性[20],可用于食品化妆品以及医药产品等领域。

3.1 抗氧化活性

叶绿素的抗氧化活性和结构中的卟啉环、植基链以及扩展的键合双键有关,尤其是卟啉环结构,它是叶绿素a化合物具有抗氧化活性的必要结构[21]。Lanfer marquez等[22]制备了不同的叶绿素衍生物,并观察其抗氧化活性,结果发现叶绿素b的衍生物比叶绿素a的抗氧化活性更强,其分子结构的醛基取代甲基后导致了更强的抗氧化活性。Cho等[23]发现从浒苔中提取的叶绿素a的衍生物脱镁叶绿素a具有比海藻多酚更强的抗氧化活性。Cahyan等[24]从褐藻中提取焦脱镁叶绿酸a(Pyropheophytin a),检测出其抗氧化活性比化学合成抗氧剂维生素E和BHT(丁基羟基甲苯)更强。Yuan等[13]从红藻海发菜中提取分离并鉴定了叶绿素成分,主要包括叶绿素a的衍生物羟基脱镁叶绿酸、羟基脱镁叶绿素、脱镁叶绿素等化合物,并检测其抗氧化活性,发现从海发菜中提取的叶绿素衍生物具有清除DPPH自由基、羟基自由基的活性,表明该类化合物具有较强的抗氧化活性。

3.2 抗炎活性

生命机体的免疫系统在刺激作用下会释放多种炎症因子,包括一氧化氮(NO)、前列腺素2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1b(IL-1b)、活性氧(ROS)[25]。海藻中的天然色素具有抗炎活性,其中岩藻黄素的抗炎活性报道较多,叶绿素衍生物的抗炎活性报道较少。从浒苔中分离的脱镁叶绿酸a能够抑制12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)导致的超氧自由基,从而抑制小鼠巨噬细胞的炎症反应[26-27]。脱镁叶绿酸a(PPBa)及其衍生物羟基脱镁叶绿酸a(HOPPBa)、铜脱镁叶绿酸a(CuPPBa)能通过抑制炎症应答，达到抑制肿瘤的作用,分别用致癌诱导剂二甲基苯蒽(DMBA)和12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)处理ICR小鼠,建立小鼠皮肤癌模型,然后局部给药PPBa(剂量160 nmol),治疗小鼠和对照组相比,显著降低小鼠皮肤癌的发病数和发病程度,实验结果表明，PPBa及其衍生物抗肿瘤机制与抑制炎症应答降低炎症因子超氧阴离子产生、抑制白介素活性有关。可食性褐藻的甲醇提取物具有强的抗炎活性,能够抑制脂多糖诱导的RAW 264.7 巨噬细胞炎性反应,通过抑制iNOS(诱导性一氧化氮合成酶)以及COX-2(环氧合酶-2)的表达,抑制并清除炎性反应中生成的炎性因子NO,实验结果表明，发挥抗炎活性的化学成分为两种叶绿素衍生物脱镁叶绿酸a和脱镁叶绿素a[28]。

3.3 抗肿瘤活性

从紫菜和浒苔中分离纯化的脱镁叶绿素a(Pheophytin a)可用于治疗鼠伤寒沙门氏菌相关的致癌作用,因其能抑制鼠伤寒中UMUC基因表达,可用于开发成预防皮肤癌的化疗药物[29-30]。

脱镁叶绿酸a可作为光动能化疗药物及辅助药物的报道很多。Yoon等[31]报道，脱镁叶绿酸a可作为光动能化疗药物,用于治疗人皮肤癌。该制剂对人皮肤癌细胞A431和G361细胞株都有明显的抑制作用,能分别激活两种细胞的ERK1/2通路和p38蛋白,发挥其抑制肿瘤增殖的作用。在移植瘤动物模型中,该制剂表现出强大的自我吞噬以及凋亡作用,从而达到抑制肿瘤的治疗效果。Tang等[32]报道，脱镁叶绿酸a作为光动能用于耐药性肝癌的治疗,其机制是通过抑制p糖蛋白介导的耐药性JNK激酶活性。

Chypre等[33]报道叶绿素衍生物脱镁叶绿酸a和紫红素-18(Purpurin 18)能束缚重组的RANKL,并抑制ELISA反应中的 RANK-RANKL 相互反应,从而抑制模型细胞的 RANKL-依赖活性,阻止RANK-表达前体细胞分化成破骨细胞。这项研究为卟啉环类小分子化合物作为非肽类治疗剂用于靶向治疗RANK and RANKL提供了思路。

3.4 抗神经活性

脱镁叶绿酸a是从褐藻中提取分离的一种叶绿素类衍生物,能够用于治疗神经性疾病如阿尔兹海默症,它能促进PC12细胞分化。脱镁叶绿素a及其类似物Vitamin B12衍生物能促进PC12细胞的神经突增生[34],其活性可能与化合物的分子量低有关,低分子量的叶绿素衍生物容易并入细胞内,从而促进神经突增生。

3.5 抗变态反应

Yoshioka等[35]报道，从褐藻中分离提取的叶绿素c2具有抗变态反应。纯化的叶绿素c2能够抑制RBL-2H3细胞的脱粒作用,从而产生抗变态反应效果,但叶绿素a和叶绿素b却没有这样的作用。脱镁叶绿酸a对某些人群还有导致过敏作用。

3.6 其他生物活性

绿藻中的叶绿素衍生物能促进哺乳动物体内二噁英毒素的排泄,可用于防治有机脂类化合物中毒[5]。

条斑紫菜的甲醇提取物含有大量叶绿素衍生物,研究结果表明,此提取物对赤潮微藻的生长具有显著抑制作用且具有浓度依赖性,同时致使米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻等3种赤潮微藻体积变小、运动能力下降、藻细胞出现空洞、细胞破碎和色素减褪等现象。赤潮微藻细胞内的叶绿素、可溶性蛋白质和多糖含量显著减低[36]。

4 应用和展望

海藻资源丰富、生长快速且含有大量陆地植物所缺乏的生物活性物质和营养物质,这些特性决定了海藻具有巨大的经济开发价值。海藻的价值不仅体现在食用方面,还广泛应用于海洋工业原料、海洋保健药物、化学化工、饲料肥料、污水净化、食品加工和美容护肤等诸多方面。海藻中的叶绿素含量丰富、用途广泛,但由于其对光、热、酸、碱、酶等理化因素敏感,应用受到限制。因此,用现代科技手段提取并纯化叶绿素及其衍生物,并对其结构加以化学修饰,制成结构明确、性质稳定的叶绿素单体或混合制剂,是叶绿素类新产品的研究热点,尤其是在功能性食品、医药、化妆品等方面有良好的开发前景。