张 耀,王财成,袁素素,张玮玮,叶秀娟

(福建省福州市福建农林大学,生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州 350002)

抗菌蛋白(Antimicrobial proteins or peptides,AMPs),存在于生物体内,是生物抵御不良外界环境过程中产生的，具有抗微生物活性的防御性蛋白或肽类,用于抵挡外来入侵病原体,是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。植物抗真菌活性蛋白,是植物长期进化过程中,自身合成的一种植物抵御外界病原真菌的物质,可以抑制真菌的生长,甚至消灭真菌[1]。目前,各国研究人员已经从多种植物中分离纯化多种抗菌蛋白,包括甘蓝[2]、褐色芸豆[3]、小红豆[4]等植物,抗菌蛋白主要存在于植物的各种组织器官中,如茎[5]、果实[6]、种子[7]等。这些抗菌蛋白在一级序列的基础上,可被分为转脂蛋白、硫堇、植物防御素、Hevein和Konttin型蛋白家族[8]。抗菌蛋白通过抑制真菌生理代谢、降解真菌细胞壁、破坏真菌细胞膜、破坏细胞中的核糖体及降解细胞中的核酸,来保护植物体免受病原菌的侵染[9-10]。目前,对于抗菌蛋白的纯化、生物活性、作用机理均有一定的研究报道[11],但相关理论和产业化生产的研究尚有待进一步深入,随着抗菌活性蛋白研究的深入,其应用范围将更加广泛。

芝麻菜(ErucasativaMill.),又名臭菜、火箭生菜等,是十字花科芝麻菜属一年生草本植物,原产于东亚与地中海。芝麻菜具有类似芝麻种子的香气、气味辛辣、生长周期短(40～60 d)等特点,欧洲国家常用其叶片做沙拉或清蒸蔬菜;由于其种子含油量高,印度、巴基斯坦等国家将其作为一种重要的油料作物[12-13]。在我国,河北、山西、陕西、黑龙江、云南、新疆等地均有芝麻菜种植[14],但其食用者较少。芝麻菜种子可采集供药用,有健胃、止血、利尿、消炎作用[15]，和其它十字花科植物相似,芝麻菜种子中富含多种天然植物化学成分,其中包括硫代葡萄糖苷(Glucosinolate)、胡萝卜素、纤维素、维生素C、黄酮类等物质[16-18],其中硫代葡萄糖苷的水解产物异硫氰酸酯(Erucin)对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用[19]。

目前,对于芝麻菜的研究主要集中于芝麻菜苷方面,同为十字花科的甘蓝[2]、荠菜[20]等中,均有纯化出抗菌蛋白,但有关芝麻菜种子中蛋白类抗菌物质的研究未见报道。本文旨在从芝麻菜种子中分离纯化一种抗真菌蛋白,并对其生物活性进行初步探究,为芝麻菜开发新的应用价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芝麻菜种子 哈尔滨市农信种子有限责任公司;小白菜炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum)、烟草炭疽病菌(Colletotrichummicotianae)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、芭乐炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani),苹果黑腐皮壳菌(Valsamali)、凸脐蠕孢菌(Setosphaeriaturcica)、落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)、稻瘟菌(Magnaportheoryzae)、长柄链格孢菌(Alternarialongipes)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、拟盘多毛胞(Pestalotiopsis) 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室;SYTOX Green染料 美国Cambrex公司;刚果红染料 上海笛柏化学品技术公司;SP-Sepharose填料、Mono STM5/50 GL预装柱、SuperdexTM75 10/300GL预装柱 美国GE公司;其余化学试剂 均为分析纯;透析袋(截留分子量3500 Da) 美国光谱医学公司。

Centrifuge 5860R型高速冷冻离心机 Eppendorf中国有限公司;WP-UP-LH-20型超纯水机 四川沃特尔水处理设备有限公司;AKTA purifiers型蛋白层析系统 美国GE公司;LCJ-18S型冷冻干燥机 上海松源华兴科技发展有限公司;DW-25L262型医用低温保存箱 海尔特种电器有限公司;SPH-200F恒温培养摇床 上海世平实验仪器有限公司;DYY-6C型电泳仪器 北京市六一仪器厂;Nikon A1型激光共聚焦电子显微镜 日本Nikon公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗真菌蛋白的纯化

1.2.1.1 总蛋白的提取 取100 g洗净芝麻菜种子,用蒸馏水清洗,除去杂质,加入1 L的NH4OAc缓冲液(10 mmol/L,pH4.6),用豆浆机打成匀浆后,置于4 ℃冰箱过夜。将浸提液在4 ℃、9000 r/min离心30 min,取上清液经四层纱布过滤,除去一些脂肪等杂质,重复离心、过滤步骤2～3次,收集上清液,得芝麻菜总蛋白提取液。

1.2.1.2 SP-Sepharose阳离子交换柱层析 预先用NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)的上样缓冲液将离子交换柱平衡,取总蛋白提取液上样,上样结束后,继续流上样缓冲液至280 nm吸光值(OD280)为0终止,收集流穿峰ZSP0。然后依次用含0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl的NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上样缓冲液进行梯度洗脱,并进行峰收集,得ZSP1、ZSP2、ZSP3组分,对各组分进行抗菌活性检测,以小白菜炭疽病菌为指示菌,收集活性组分,并用蒸馏水在4 ℃透析12 h,截留分子量3500 Da,每3 h换一次蒸馏水,并将透析后的活性成分在-60 ℃冷冻干燥成干粉,即得芝麻菜抗菌蛋白粗品。

1.2.1.3 快速蛋白液相色谱Mono STM5/50GL强阳离子交换层析 按照AKTA pure蛋白纯化系统操作要求,将强阳离子交换柱Mono STM5/50GL与系统连接,用NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上样缓冲液平衡,将上述活性组分溶解于上样缓冲液,过0.22 μm滤膜后上样,上样结束后,继续流上样缓冲液至OD280为0,收集流穿峰ZMS0。然后在含0～1 mol/L NaCl的NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上样缓冲液进行线性洗脱,得ZMS1、ZMS2和ZMS3三个洗脱峰。对各组分进行抗菌活性检测,以小白菜炭疽病菌为指示菌,收集活性组分,并透析和冷冻干燥。

1.2.1.4 快速蛋白液相色谱SuperdexTM75 10/300GL凝胶柱层析 将凝胶柱SuperdexTM75 10/300GL与AKTA pure蛋白纯化系统连接,用NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上样缓冲液平衡,将过完强阳离子交换柱Mono STM5/50GL得到的活性组分溶于上样缓冲液,过0.22 μm滤膜后上样,上样结束继续流上样缓冲液至OD280为0,对吸收峰进行收集,分别为ZSU1、ZSU2、ZSU3。对各组分进行抗菌活性检测,小白菜炭疽病菌为指示菌,收集活性组分,透析并冷冻干燥。

1.2.2 Tricine-SDS-PAGE电泳 将纯化的活性蛋白运用Tricine-SDS-PAGE电泳方法[2]进行分析鉴定,分别使用16.5%分离胶,10%夹层胶,4%浓缩胶。电泳条件的起始电压为30 V,进入分离胶后升至80 V。电泳结束后,用考马斯亮蓝染液染色1 h,后用脱色液进行脱色,观察蛋白条带情况。

1.2.3 抑菌活性的检测 运用滤纸片扩散法,将待测的植物病原真菌接菌于含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养皿中,生长至圆面直径为3 cm,将灭菌的滤纸圆片放在距离菌边缘0.5 cm处,滴加20 μL的待测抗菌蛋白样品(1 mg/mL)在滤纸圆片上,无菌水为对照,放置在28 ℃恒温培养箱中,继续培养至菌边缘长至滤纸片处,观察有无抑菌活性。

1.2.4 抗菌蛋白的稳定性实验

1.2.4.1 抗菌蛋白的热稳定性 取抗菌蛋白1 mg溶解于1 mL的PBS缓冲液(pH7.4)中,等量分装到到4个1.5 mL的离心管中,分别在40、60、80和100 ℃条件下水浴加热15 min,待溶液冷却至室温,在8000 r/min离心5 min,取上清液,以小白菜炭疽病菌为指示菌,检测抑菌活性,分别以PBS缓冲液(pH7.4)为阴性对照,未处理的抗菌蛋白溶液为阳性对照,设三个重复,记录实验结果。

1.2.4.2 抗菌蛋白的pH稳定性 取1 mL抗菌蛋白溶液(1 mg/mL),分别取pH为1、2、3、11、12、13的PBS缓冲液(pH7.4)90 μL,加入10 μL上述抗菌蛋白溶液混匀,静置30 min后,以小白菜炭疽病菌为指示菌,检测抑菌活性,以PBS缓冲液(pH7.4)为阴性对照,未处理的抗菌蛋白溶液为阳性对照,设三个重复,记录实验结果。

1.2.4.3 抗菌蛋白金属离子稳定性实验 分别用无菌水配制40、100、200、300 mmol/L的CaCl2、FeCl3、KCl、MgCl2、MnCl2溶液备用。取20 μL的抗菌蛋白溶液(1 mg/mL)与20 μL上述金属盐溶液混合,室温放置1 h后,以小白菜炭疽病菌为指示菌,进行抑菌活性检测。分别以不含抗菌蛋白但含150 mmol/L金属离子的溶液作为阴性对照,未处理的抗菌蛋白溶液为阳性对照,设三个重复,记录实验结果。

1.2.5 抗真菌蛋白的作用机理

1.2.5.1 蛋白菌丝尖端几丁质积累检测 小白菜炭疽病菌接菌于马铃薯液体培养基(PDB)中,150 r/min,28 ℃摇床培养至OD600为1时,吸取菌悬液,稀释10倍,加入抗菌蛋白溶液,继续摇床培养1 d,离心得菌丝,多余抗菌蛋白用PBS缓冲液(pH7.4)清洗,然后接菌在PDA培养基上,28 ℃恒温培养7 d,PBS缓冲液(pH7.4)处理菌丝为对照。在1.5 mL离心管中,分别加抗菌蛋白溶液和PBS缓冲液(pH7.4),在靠近培养皿边缘处挑取菌块加入离心管,28 ℃培养1 d,用PBS缓冲液(pH7.4)清洗,加入刚果红(Congo red)染料,黑暗、室温条件下着色30 min,PBS缓冲液(pH7.4)反复冲洗去除多余染液,挑取真菌菌丝制成玻片,运用激光共聚焦电子显微镜进行观察,激发波长543 nm,发射波长560～635 nm。

1.2.5.2 细胞膜选择透过性检测 无菌条件下,在两个1.5 mL离心管(灭过菌)加入900 μL PDB液体培养基,挑取活化指示菌菌块放入培养基中,28 ℃培养 2 d,分别向上述两个离心管中加入抗菌蛋白溶液和PBS缓冲液(作对照),28 ℃培养12 h,用PBS缓冲液(pH7.4)清洗,加入荧光绿(SYTOX Green)染料,黑暗条件下着色30 min,PBS缓冲液(pH7.4)洗去多余染液,制备玻片,运用激光共聚焦扫描荧光显微镜进行观察,激发波长504 nm,发射波长523 nm。

1.3 数据处理

所有数据均取3次重复实验的平均值,采用Excel、Word软件进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 芝麻菜抗菌蛋白的纯化

芝麻菜种子经破碎、离心和过滤得到总蛋白提取液,经SP-Sepharose阳离子交换色谱进行纯化,在280 nm检测洗脱液吸光度,得到的色谱图如图1所示。通过抑菌实验,发现在含有0.5 mol/L NaCl的NH4OAc缓冲液(10 mmol/L,pH4.6)洗脱出的ZSP3洗脱峰具有抗真菌菌活性,收集ZSP3组分,并透析和冷冻干燥,得到ZSP3蛋白干粉。

图1 芝麻菜种子抗菌蛋白的SP-Sepharose离子交换色谱图Fig.1 Ion exchange chromatography of the antifungal protein from arugula seeds on SP-Sepharose

在AKTA pure蛋白纯化系统中,将ZSP3蛋白干粉溶解于NH4OAc缓冲液(10 mmol/L,pH4.6)中,经0.22 μm滤膜后上样至Mono STM5/50GL离子交换色谱柱中,通过含0～1 mol/L NaCl的NH4OAc缓冲液(10 mmol/L,pH4.6)线性洗脱,得到ZMS1、ZMS2和ZMS3三个洗脱峰(图2)。通过抑菌实验,测得ZMS1具有抗真菌活性,收集ZMS1峰组分,并透析和冷冻干燥,得ZMS1蛋白干粉。

图2 芝麻菜种子抗菌蛋白的Mono STM5/50GL离子交换色谱图Fig.2 Ion exchange chromatography of the antifungal protein from arugula seeds on Mono STM5/50GL

将ZMS1蛋白干粉溶解于NH4OAc缓冲液(10 mmol/L,pH4.6)中,经0.22 μm滤膜后上样至AKTA pure蛋白纯化系统中的SuperdexTM75 10/300GL凝胶色谱柱,得到ZSU1、ZSU2和ZSU3三种组分(图3)。经抑菌实验测得ZSU2组分具有抗菌活性,即ZSU2组分为目标活性组分,本文章命名为ZSU2蛋白。收集目标组分,透析干燥,并重复制备,以备后续研究。

图3 芝麻菜种子抗菌蛋白的SuperdexTM 75 10/300GL凝胶过滤色谱图Fig.3 Gel filtration chromatography of the antifungal protein from arugula seeds on SuperdexTM 75 10/300GL

2.2 Tricine-SDS-PAGE电泳

采用Tricine-SDS-PAGE电泳方法检测ZSU2蛋白的纯度以及分子量大小,由图4结果中可知,ZSU2蛋白为单一条带,分子量大小约为12 kDa左右,与油菜种子(9412 Da)[21]中纯化的抗菌蛋白分子量相近。

图4 芝麻菜抗菌蛋白Tricine-SDS-PAGE电泳图Fig.4 Tricine-SDS-PAGE of the antifungal protein from arugula seeds注:ZSU2:芝麻菜抗菌蛋白ZSU2;M:蛋白分子质量标准。

2.3 抑菌活性检测

采用滤纸片扩散法,若样品对真菌具有抑制作用,则滤纸片周围菌丝生长受到抑制,出现半圆形的月牙状抑菌圈。图5的实验结果表明,ZSU2对苹果黑腐皮壳菌、凸脐蠕孢菌、玉米小斑病菌、落花生球腔菌、芭乐炭疽病菌、稻瘟菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、小白菜炭疽菌和长柄链格孢菌12种植物病原真菌具有较强抑制活性,对拟盘多毛胞和烟草炭疽病菌抑制活性较弱。ZSU2蛋白对植物病原真菌具有广谱抗性。油菜[22]、芥蓝[23]和菜薹[7]等多种十字花科植物种子的抗菌蛋白对多种植物病原菌具有抑制活性,十字花科许多种子抗菌蛋白具有广谱抗性的共性。

图5 芝麻菜抗真菌蛋白抑菌活性Fig.5 Inhibitory activity of the antifungal protein from arugula seeds注:A-1:苹果黑腐皮壳菌;A-2:凸脐蠕孢菌;A-3:玉米小斑病菌;A-4:落花生球腔菌;A-5:芭乐炭疽病菌;A-6:稻瘟菌;A-7:禾谷镰刀菌;A-8:尖孢镰刀菌;A-9:拟盘多毛孢;A-10:茄病镰刀菌;A-11:灰葡萄孢菌;A-12:小白菜炭疽病菌;A-13:烟草炭疽病菌;A-14:长柄链格孢菌;CK:PBS缓冲液;T:20 μL芝麻菜抗真菌蛋白溶液。

2.4 芝麻菜抗菌蛋白稳定性

将处理后的样品10000 r/min离心5 min后,取上清液分别检测其抑菌活性。由图6A可以发现,芝麻菜抗菌蛋白在40、60、80和100 ℃条件下水浴加热处理15 min后,与未处理的芝麻菜抗菌蛋白样品在小白菜炭疽病菌平板上,均有月牙状抑菌圈出现,且大小基本相同,而PBS缓冲液对照则无抑菌圈出现,说明芝麻菜抗菌蛋白在热处理后抑菌活性基本保持不变,也表明起抗菌作用的ZSU2蛋白具有良好的热稳定性。

图6 温度和pH对抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.6 Effect of temperature and pH on antibacterial activity of antimicrobial protein注:A. 热稳定性实验,A中40、60、80、100分别对应40、60、80、100 ℃水浴处理下蛋白加样点;B. pH稳定性实验,B中1、2、3、11、12、13代表相应pH处理的蛋白加样点;图A～B中,CK+:20 μL未处理抗菌蛋白溶液;CK-:20 μL PBS缓冲液。

将芝麻菜抗菌蛋白分别经不同pH条件处理,测定其对pH的稳定性。从图6B中可以看出,芝麻菜抗菌蛋白在pH1～3和pH11～13的条件下处理后,与未处理的芝麻菜抗菌蛋白样品在小白菜炭疽病菌平板上均有月牙状抑菌圈出现,且大小基本相同,而PBS缓冲液对照则无抑菌圈出现,说明芝麻菜抗菌蛋白具有良好的耐酸耐碱活性,即能在极端pH的环境中保持较好的稳定性。

将芝麻菜抗菌蛋白分别经过20、50、100和150 mmol/L的CaCl2、FeCl3、KCl、MgCl2、MnCl2金属盐溶液处理,得到结果如表1,K+、Mg2+、Mn2+和Ca2+浓度在20～150 mmol/L时,Fe3+浓度在20～100 mmol/L时,芝麻菜抗菌蛋白具有良好的抗菌活性,Fe3+浓度达到150 mmol/L时,芝麻菜抗菌活性明显减弱。说明芝麻菜抗菌蛋白具有较好的金属离子稳定性。

表1 ZSU2蛋白金属离子稳定性Table 1 Metal ion stability of ZSU2 protein

2.5 抗菌蛋白的抗真菌机理

采用刚果红和荧光绿染色,激光共聚焦显微镜观察的方法,检测抗菌蛋白处理后，小白菜炭疽病菌菌丝尖端几丁质的积累量和菌丝细胞膜透性的变化,以等量PBS缓冲液处理的小白菜炭疽病菌菌丝作对照,判断抗菌蛋白是否通过真菌菌丝尖端几丁质积累和改变细胞膜透性,从而抑制真菌的生长。实验结果如图7～图8。

图7 小白菜炭疽病菌刚果红染色共聚焦电镜图Fig.7 Fluorescence micrope images of Colletotrichum higginsianum hyphae stained with Congo red

刚果红(Congo red)染料能够结合菌丝细胞壁上的几丁质,从而将菌丝染色。本研究采用小白菜炭疽病菌为指示菌,由图7可知,ZSU2蛋白处理组菌丝尖端染色明显强于对照组,即经过ZSU2蛋白处理的小白菜炭疽病菌菌丝尖端出现了几丁质的积累,说明芝麻菜种子抗菌蛋白可能是通过菌丝尖端几丁质积累,从而使菌丝生长受阻,进而起到抑菌作用。

荧光绿(SYTOX Green)是一种核酸染料,能够轻松透过质膜受损的细胞使核酸染色,不能穿过完整的活的细胞膜。由图8可知,ZSU2蛋白处理组菌丝内有绿色荧光出现,而对照组菌丝内无任何荧光,说明ZSU2蛋白抑制小白菜炭疽病菌时,小白菜炭疽病菌丝选择透过性增大,细胞膜完整性被破坏,从而使得荧光染料进入菌丝细胞内而显示绿色荧光,对照组菌丝细胞膜未受到影响而不着色。在对紫甘蓝种子抗菌蛋白抑制落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)时,抗菌蛋白同样引起细胞选择透过性的改变[16]。因而推测,ZSU2蛋白可导致小白菜炭疽病菌菌丝细胞膜选择透过性的改变,进而抑制菌丝的生长。

图8 小白菜炭疽病菌荧光绿染色共聚焦电镜图Fig.8 Fluorescence micrope images of Colletotrichum higginsianum hyphae stained with SYTOX Green

3 结论

本研究通过破碎离心过滤、SP-Sepharose柱层析、Mono STM5/50GL柱层析和SuperdexTM75 10/300GL柱层析等步骤,从芝麻菜种子中分离纯化出一种抗菌蛋白ZSU2。对ZSU2蛋白进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,对比发现,经凝胶过滤柱层析后得到的ZSU2蛋白达到电泳纯,且相对分子质量约为12 kDa。通过纯化的ZSU2蛋白对苹果黑腐皮壳菌、凸脐蠕孢菌、玉米小斑病菌、落花生球腔菌、芭乐炭疽病菌、稻瘟菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、小白菜炭疽菌和长柄链格孢菌共12种植物病原真菌的抑菌实验证明,ZSU2蛋白具有广谱的抗真菌活性。根据温度、pH和金属离子的稳定性实验,可知ZSU2蛋白具有良好的耐热、耐酸碱和金属阳离子耐受能力,对环境的适应能力较好。通过刚果红、荧光绿染色,激光共聚焦电子显微镜观察表明,经ZSU2蛋白处理的真菌菌丝尖端几丁质积累增加、细胞膜透性增大,细胞膜完整性被破坏,从而可能抑制了真菌菌丝的生长。