蓝尉冰,徐开平,韩 鑫,陈美花

(1.钦州学院,广西钦州 535099; 2.广西大学,广西南宁 530004; 3.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室,广西钦州 535099)

甲壳素又称几丁质,属于天然高分子,其用途广泛,可用于食品、化学、药学、农学等领域。甲壳素来源广泛,主要存在于虾、蟹壳等甲壳生物。南美白对虾(PenaeusvannameiBoone),原产地为美国南部的太平洋海岸,后逐渐引入中国并大量养殖。目前,南美白对虾养殖在我国得到了一定程度的发展,但我国对虾除鲜虾销售外,大部分被加工成冷冻虾仁出口,造成大量虾类废弃物[1]。因此,虾类废弃物的综合利用成为水产品加工热点之一。

近年来,我国对虾头、虾壳等废弃物利用已引起重视,但仍处在起步阶段。传统虾废弃物主要被加工成饲料,其经济利用价值低。南美白对虾虾头、虾壳含大量甲壳素[2],是生产甲壳素的良好原料。目前以虾头虾壳为原料获得甲壳素,已引起越来越多的学者与企业家的重视。国内外甲壳素制备方法主要有酶法[3]、发酵法[4]、化学改良法[5]、传统酸碱法等。酶法存在耗时长、不可循环利用等问题;发酵法操作复杂、生产条件严格且周期长;化学改良法工艺条件不完善,存在碱性较强等问题;传统酸碱法能耗高、耗时、耗力,且环境污染较严重。故寻求一种省时、省力、经济、环保的甲壳素制备技术迫在眉睫。

微波技术是一门绿色环保技术,其主要原理是中粒子在微波磁场中会因微波频率的提高而急速更改方向,使分子间发生撞击现象,产生大量热量从而让温度迅速升高[6],使固体样品表面迅速裂解,并能够在数分钟内完全分解。微波技术相比其他方法,具有操作简单、节省时间的优点。目前,利用微波技术制备广西北部湾地区南美白对虾甲壳素未见报道。

本实验在传统酸碱法的基础上,采用微波辅助法制备南美白对虾虾头、虾壳中的甲壳素,通过单因素试验和正交试验进行脱蛋白及脱钙,探讨微波辅助法制备甲壳素的最佳工艺条件。以期为我国虾头、虾壳等废弃物甲壳素的制取提供数据基础,为水产品高值化利用提供技术支持,以此带动广西北部湾经济的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾 钦州市东风市场,洗净后取虾头、虾壳经60 ℃烘10 h烘干、粉碎,过60目筛备用;95%乙醇、氢氧化钠、盐酸 分析纯,成都市科隆化工试剂厂;乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、考马斯亮蓝G-250 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;铬黑T 分析纯,天津市光复精细化工研究所;标准蛋白 碧云天生物技术有限公司。

FA2004电子分析天平 上海耀杰有限公司;ZRD-A5110全自动新型鼓风干燥箱 上海智城分析仪器制造有限公司;G80D23CN2P-T7(B0)微波炉 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司;V-1800PC可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;SZ-500A-3超高速多功能粉碎机 永康市善竹贸易有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虾头、虾壳中甲壳素的制备工艺流程

1.2.1.1 传统酸碱法制备虾头、虾壳中甲壳素 称取2.00 g预处理样品，调整料液比为1∶25 g/mL，打浆后置于250 mL烧杯中，加入5.2 g NaOH，使其最终浓度为10%(w/w)，100 ℃水浴恒温1.5 h后，抽滤得到脱蛋白后的虾壳，用超纯水洗涤至中性，得到脱蛋白残渣，测定其蛋白含量，并计算脱蛋白率。然后向已脱蛋白残渣中，按5%(w/w) 加入HCl溶液，常温浸泡8 h，超纯水洗涤至中性，测定其含钙量，并计算脱钙率。用10% H2O2溶液常温脱色1 h，抽滤，60 ℃烘干即得甲壳素[7]，并计算甲壳素得率。

1.2.1.2 微波辅助法制备虾头、虾壳中甲壳素 称取2.00 g预处理样品,按照一定料液比加入一定的水打浆,后于250 mL烧杯中,加入一定量的NaOH溶液混匀后,在一定的微波功率和时间下进行处理。后用超纯水洗涤至中性,抽滤,60 ℃烘10 h,称量,取滤液在波长595 nm条件下进行吸光度的测定,计算蛋白含量[8]。取已脱蛋白的残渣按一定比例,加入11.7 mol/L HCl溶液搅拌均匀后,在一定功率及时间下进行微波处理。后超纯水洗涤至中性,抽滤,60 ℃烘10 h,称量,取滤液进行EDTA滴定,计算钙含量。最后,用10% H2O2对已脱蛋白脱钙的滤渣进行脱色处理2.0 h,抽滤,60 ℃烘干即得甲壳素[9]。

1.2.2 微波辅助法脱蛋白的工艺优化

1.2.2.1 单因素实验 采用1.2的操作进行。固定微波时间为5 min,NaOH浓度5%,料液比1∶25 g/mL,考察微波功率(160、240、320、400、480 W)对脱蛋白率的影响;固定微波功率240 W,NaOH浓度5%,料液比1∶25 g/mL,考察微波时间(3、5、7、9、11 min)对脱蛋白率的影响;固定微波功率240 W,微波时间5 min,料液比1∶25 g/mL,考察NaOH浓度(2%、4%、6%、8%、10%)对脱蛋白率的影响;固定微波功率240 W,微波时间5 min,NaOH浓度6%,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对脱蛋白率的影响。

1.2.2.2 正交试验 在单因素实验的基础上,采用四因素三水平正交试验设计,对虾头、虾壳微波辅助法脱蛋白的最佳工艺进行优化,正交试验因素与水平见表1。

表1 微波辅助法脱蛋白的正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test for deproteinization by microwave assisted method

1.2.3 微波辅助法脱钙的工艺优化

1.2.3.1 单因素实验 采用1.2的操作进行,在脱蛋白率正交实验优化结果的基础上进行脱钙单因素实验。固定微波时间4 min,HCl浓度3%,料液比1∶30 g/mL,考察微波功率(160、240、320、400、480 W)对脱钙率的影响;固定微波功率240 W,HCl浓度3%,料液比1∶30 g/mL,考察微波时间(2、3、4、5、6 min)对脱钙率的影响;固定微波功率为240 W,微波时间4 min,料液比1∶30 g/mL,考察HCl浓度(1%、2%、3%、4%、5%)对脱钙率的影响;固定微波功率240 W,微波时间4 min,HCl浓度4%,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)对脱钙率的影响。

1.2.3.2 正交试验 在单因素试验的基础上,采用四因素三水平,按正交试验设计对虾头、虾壳中钙的不同脱除效果最佳工艺研究,正交试验因素与水平见表2所示。

表2 脱钙率的正交试验因素与水平表Table 2 Orthogonal test factors and level table for decalcification rate

1.2.4 微波辅助法与传统酸碱法对比 在微波辅助法脱蛋白、脱钙的最优工艺条件下，制备甲壳素，分别测定脱蛋白率、脱钙率及甲壳素得率。后与1.2.1.1中传统工艺的实验结果进行对比。

1.2.5 指标的测定

1.2.5.1 脱蛋白率的测定 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。根据试验溶液按表3将配制好的各试管溶液在595 nm波长下比色,记录每根管所得的吸光度值,以标准蛋白质含量作为横坐标,取吸光度作为纵坐标,绘制标准曲线,得出标准曲线方程为y=0.0051x+0.0032,相关系数R2=0.9997。

表3 标准曲线试剂添加表Table 3 Reagent addition of standard curve

取0.10 mL经微波辅助脱除蛋白质后的滤液于试管中,加入蒸馏水0.90 mL和考马斯亮蓝试剂5.00 mL,在595 nm测吸光度值[10],通过吸光度值与标准蛋白质浓度曲线求出蛋白含量。其中蛋白质含量记为X(μg),预处理样品中蛋白质的质量分数记为X1(%),提取液总体积记为V1(mL),测定时取用提取液体积记为V0(mL),预处理样品的质量记为m0(g)。脱蛋白率α计算公式:

式(1)

1.2.5.2 脱钙率的测定 取脱钙后的滤液2.50 mL,加入5.00 mL蒸馏水和1.00 mL10% NaOH溶液,加入几滴K-B指示剂,摇匀,用EDTA溶液进行滴定。溶液从紫红色到蓝色时即为滴定终点,记录消耗的EDTA体积[11]。其中滴定时取用提取液体积记为V(mL),提取液总体积为V2(mL);滴定消耗的体积记为VEDTA(M1);EDTA浓度记为CEDTA(mol/L);钙的摩尔质量记为Mca(g/mol);脱蛋白后样品的质量记为m(g);脱蛋白后样品中钙的质量分数记为X2(%)。脱钙率计算公式如下:

式(2)

1.2.5.3 甲壳素得率的测定

式(3)

式(3)中,m:脱蛋白、脱钙后所得的甲壳素的质量(g);m0:预处理样品的质量(g)。

1.3 数据处理

用Design-Expert 8.0.5b软件和origin 8.0软件处理实验所得数据。

2 结果与分析

2.1 脱蛋白工艺的实验结果与分析

2.1.1 单因素实验结果

2.1.1.1 微波功率对脱蛋白率的影响 由图1可知,在微波功率为160～240 W时,脱蛋白率随功率增大而增大;微波功率为240 W时,达最大值为62.3%。可能是因为,在一定微波时间内,微波功率越高,系统可以摄取更多的微波能,升温加快,对细胞系统的破坏作用较大,有利于虾壳中蛋白质成分的浸出[12]。随后微波功率高于240 W时,脱蛋白率随微波功率增大而减小,可能是因为,微波功率太高,快速加热会使得液体沸腾溢出,且高温并使蛋白质容易发生变性。因此,选取微波功率240 W。

图1 微波功率对脱蛋白率的影响Fig.1 Effect of microwave power on deprotein rate

2.1.1.2 微波时间对脱蛋白率的影响 由图2可知,微波时间小于5 min时,蛋白质的脱除效果随微波时间增加而增大;微波时间大于5 min后,蛋白质的脱除效果随时间增加而降低;微波时间为5 min时,脱蛋白率最高。原因可能是,在短时间内,微波作用在细胞膜上并使其发生较严重的破碎作用,使虾头、虾壳内部的蛋白质分子加剧运动,从而扩散出来。当微波到一定时间后,可能存在溶解度达到饱和时,蛋白质会发生降解现象[13]。故微波时间选为5 min。

图2 微波时间对脱蛋白率的影响Fig.2 Effect of microwave time on deprotein rate

2.1.1.3 NaOH浓度对脱蛋白率的影响 由图3可知,脱蛋白率随NaOH浓度升高,呈现先增加后降低的趋势;NaOH浓度为6%时,脱蛋白率最高;可能是NaOH浓度过大,使虾头、虾壳中的蛋白质水解,在碱性条件下,形成游离的氨基酸,从而减少了蛋白质质量,脱蛋白率降低[14]。故NaOH浓度选为6%。

图3 NaOH浓度对脱蛋白率的影响Fig.3 Effect of NaOH concentration on deprotein rate

2.1.1.4 料液比对脱蛋白率的影响 由图4可知,料液比为1∶10～1∶15时,脱蛋白率随着料液比的增大而增大,随后小幅度下降。可能是因为,料液比变大,在制备过程中,液相浓度的增加也随之加快。故选择的料液比为1∶15 g/mL。

图4 料液比对脱蛋白率的影响Fig.4 Effect of ratio of material to liquid on deprotein rate

2.1.2 正交试验结果 由表4可知各因素对脱蛋白率的影响依次为:料液比(D)>微波功率(B)>NaOH浓度(A)>微波时间(C)。最优脱蛋白工艺为A2B2C3D1,即NaOH浓度6%,微波功率240 W,微波时间7 min,料液比1∶10 g/mL,恰为正交实验的第5组,而第5组也正是9组实验中的最大组。其中,由表5可知,微波功率对虾头、虾壳脱蛋白效果的影响显著(p<0.05),料液比对脱蛋白效果的影响极显著(p<0.01),说明微波功率、料液比对脱蛋白率的影响较大。

表4 正交试验直观分析结果Table 4 Results of intuitionistic analysis of orthogonal test

表5 正交试验方差分析结果Table 5 Result of orthogonal test analysis of variance

2.2 脱钙工艺的实验结果与分析

2.2.1 单因素实验结果

2.2.1.1 微波功率对脱钙率的影响 由图5可知,随着微波功率升高,脱钙率先上升后下降,微波功率240 W时,脱钙率达最大值为93.1%。可能是因为,在微波电磁场作用下,极性分子的排列快速转向,钙凌乱产生热摩擦及碰撞,导致钙分子分离出来。但微波功率过高,微波的作用下,反应混合物中的矿物质、无机酸分子与微波发生了强烈的耦合作用,使得脱钙效果降低[15]。故微波功率选为240 W。

图5 微波功率对脱钙率的影响Fig.5 Effect of microwave power on decalcification rate

2.2.1.2 微波时间对脱钙率的影响 由图6可知,脱钙率随微波时间的增加呈现先增加后降低的趋势,在2～4 min范围内逐渐增加,这段时间内虾头虾壳中的钙逐渐地与盐酸反应,使钙离子从分子中脱离出来。在4 min时脱钙率达到最大,之后逐渐下降。原因可能是,在一定的微波功率下,随着微波时间的延长,钙离子的稳定性变差,其内部受到破坏,使得钙含量减少[16]。故选择微波时间为4 min。

图6 微波时间对脱钙率的影响Fig.6 Effect of microwave time on decalcification rate

2.2.1.3 HCl浓度对脱钙率的影响 由图7可知,脱钙率随着HCl浓度的增大呈现先增大后下降的趋势;HCl浓度为1%～3%时,脱钙率迅速升高,HCl浓度为4%时,脱钙率达到最大值,HCl浓度高于4%时,脱钙率缓慢降低。可能是因为,HCl浓度较大,在脱除过程中,无机盐会发生降解反应,使脱钙率降低[17]。故选择HCl浓度为4%。

图7 HCl浓度对脱钙率的影响Fig.7 Effect of HCl concentration on decalcification rate

2.2.1.4 料液比对脱钙率的影响 由图8可知,料液比为1∶20～1∶35 g/mL范围内,脱钙率随料液比的增加而增大;料液比1∶35 g/mL时,脱钙率达到最高;料液比高于1∶35 g/mL后,脱钙率开始缓慢下降。可能是因为,料液比太低时,虾头、虾壳中的钙无法与盐酸充分反应从溶液中脱离出来;料液比过高时,会使钙离子降解[18]。故选择料液比为1∶35 g/mL。

图8 料液比对脱钙率的影响Fig.8 Effect of ratio of material to liquid on decalcification rate

2.2.2 正交试验结果 由表6可知,微波技术对脱钙率的影响依次为:HCl浓度(A)>微波功率(B)>微波时间(C)>料液比(D)。最优脱钙率工艺为A3B1C1D3,即HCl浓度5%,微波功率160 W,微波时间3 min,料液比1∶40 g/mL。由表7可知,HCl浓度、微波功率和微波时间对虾头、虾壳中的脱钙效果的影响具有显著性(p<0.05),说明这三个因素对于脱钙率的影响较大。

表6 正交试验结果Table 6 Results of orthogonal test

表7 正交试验方差分析结果Table 7 Results of analysis of variance of orthogonal test

由表6可知,最佳工艺条件A3B1C1D3未在正交表中,故需进行验证试验,验证结果分别为90.35%、91.79%、91.64%,平均脱钙率为91.26%,高于表6的每一项试验结果,因此脱钙工艺的最佳条件是:HCl浓度5%,微波功率160 W,微波时间3 min,料液比1∶40 g/mL。

2.3 微波辅助法与传统工艺的比较分析结果

采用微波辅助法与传统酸碱法制备粗甲壳素,前者脱蛋白率、脱钙率及甲壳素得率为70.85%、91.26%、26.34%,后者为42.15%、64.84%、18.43%,通过比较可知,微波辅助法明显优于传统酸碱法。因此,微波消解技术为今后研究甲壳素的制备方法提供坚实的理论基础。

3 结论

采用微波辅助法制备广西北部湾地区南美白对虾甲壳素并对制备工艺进行了优化。通过正交优化得到最佳工艺参数为:NaOH浓度6%,微波功率240 W,微波时间7 min,料液比1∶10 g/mL,脱蛋白率70.85%;HCl浓度5%,微波功率160 W,微波时间3 min,料液比1∶40 g/mL,脱钙率为91.26%。在此条件制得的甲壳素得率为26.34%±0.24%。优于传统酸碱法甲壳素得率(18.43%±0.14%)。微波辅助法是非常具有应用前景的制备甲壳素的新方法,为研究我国虾头、虾壳等废弃物制取甲壳素提供技术基础。