李雯翀?朱咏瑶?刘抐岢?陈庆隆

[摘要] 目的 探讨2型糖尿病（T2DM）与患者KCNJ11启动子区部分CpG位点的甲基化的相关性。 方法 选取15例新發单纯性2型糖尿病患者和15例健康正常对照者，用亚硫酸盐法测定KCNJ11基因启动子5端300bp中的46个CpG位点DNA甲基化水平，用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定KCNJ11基因转录表达。 结果 在KCNJ11启动子区的实验区域存在多个甲基化水平增高的位点，两组比较，总甲基化比率及其mRNA表达无明显差异（t=1.0323；P>0.05），每个研究对象KCNJ11启动子区的CpG+62、CpG+66、CpG+351位点甲基化比率均有升高，两组间比较无明显差异（t=0.2582，0.7821，1.1859；P>0.05），但CpG+78、CpG+96、CpG+100、CpG+104、CpG+108、CpG+111、 CpG+21、 CpG+129、 CpG+132、CpG+136、CpG+141、CpG+168、CpG+174、CpG+178、CpG+201、CpG+210、CpG+215、 CpG+219、 CpG+223、CpG+233、CpG+248、CpG+268、CpG+270、CpG+272、CpG+288、CpG+324等26个位点的甲基化比率在2型糖尿病组的个别患者中有所升高，而在健康正常对照组却未出现甲基化。 结论 2型糖尿病患者KCNJ11启动子区甲基化呈现异常，可能参与2型糖尿病的发病。

[关键词] 2型糖尿病；DNA甲基化；聚合酶联反应；KCNJ11

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）16-10-05

Preliminary study of KCNJ11 promoter methylation in patients with type 2 diabetes mellitus

LI Wenchong ZHU Yongyao LIU Ruike CHEN Qinglong

Department of Endocrinology， Dongguan Third People's Hospital of Dongguang， Guangdong， Dongguang 523320， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between methylation of partial CpG site in KCNJ11 promoter region and type 2 diabetes mellitus （T2DM）. Methods 15 patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus and 15 healthy controls were enrolled， DNA methylation levels of 46 CpG loci in 300bp gene promoter 5 were measured by sulfite assay in the promoter of KCNJ11 gene promoter. The transcription of KCNJ11 gene was measured by semi quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results In the experimental region of the KCNJ11 promoter region， multiple methylation levels were increased. The ratio of total methylation and its expression of mRNA were not significantly different between the two groups （P>0.05）. Each object of study of the promoter region of KCNJ11 CpG+62， CpG+66， CpG+351 methylation ratio increased， no significant difference between two groups between （P>0.05）， but increased the methylation ratio of CpG+78， CpG+96， CpG+100， CpG+104， CpG+108， CpG+111， CpG+21， CpG+129， CpG+132， CpG+136， CpG+141， CpG+168， CpG+174， CpG+178， CpG+201， CpG+210， CpG+215， CpG+219， CpG+223， CpG+， CpG+248， CpG+268 233， CpG+270， CpG+272， CpG+288， CpG+324 etc. 26 loci in individual patients with type 2 diabetes group， while in the normal control group without methylation. Conclusion Methylation of KCNJ11 promoter region is abnormal in type 2 diabetes mellitus， and it may be involved in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus.endprint

[Key words] Type 2 diabetes mellitus； DNA methylation； Polymerase chain reaction； KCNJ11

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是指占糖尿病总数95%以上的，以不同程度胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗共存所致的原发性糖尿病。越来越多的研究[1]表明，遗传与表观遗传机制共同

在T2DM患者的发病过程中起重要作用。有学者研究发现，KCNJ11基因与2型糖尿病的发生发展密切相关，其启动子区甲基化可能在其中發挥重要作用[2]。本研究选取2014年4月～2015年4月我院初治T2DM患者15例，探讨T2DM患者KCNJ11启动子区甲基化，以及比较在2型糖尿病患者及健康正常对照者的mRNA表达情况，从表观遗传学角度解释T2DM的致病机制。结果令人满意，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年4月～2015年4月我院初治T2DM患者15例，为东莞市第三人民医院内分泌科确诊的新发单纯性T2DM患者（依照WHO1999诊断标准），男9例，女6例，平均年龄（57.0±13.1）岁。同一时间选取年龄、性别匹配的正常对照组15例，选自无糖尿病、自身免疫性疾病及其家族史的健康志愿者；男9例，女6例，平均年龄（56.7±10.1）岁：75g口服葡萄糖耐量实验（oral glucose toleran test，OGTT）：空腹血糖<5.6mmol/L，糖负荷2h血糖<7.8mmol/L。患者均在医师告知下自愿配合完成本次研究；排除既往明确诊断为糖尿病患者；排除合并有严重感染、免疫功能疾病、恶性肿瘤、肝肾功能不全及心功能障碍患者；排除妊娠期、哺乳期患者；排除治疗和随访期间失访患者。两组患者基线资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 选取我院内分泌科初治T2DM患者15例，收集所有受试者晨起空腹静脉血各4mL分别注入EDTA-K2的抗凝管内（2支管各2mL）和干燥管内（1支管3mL），一支EDTA-K2的抗凝管常规分离血浆行静脉血浆血糖测定，干燥管常规分离血浆后取血清行胰岛素、C-肽测定。日立7170A全自动生化分析仪测定血糖，葡萄糖氧化酶法测定血浆血糖，糖化血红蛋白（HbA1C）检测采用高压液相色谱法，运用深圳迈瑞全自动糖化血红蛋白分析仪进行检测。德国西门子ADVIACENTAUR CP全自动免疫分析仪化学发光免疫分析法测定血清胰岛素、C-肽。两支EDTA-K2的抗凝管抗凝血备存于-80℃冰箱行基因测定。

1.2.2 CpG岛预测 KCNJ11启动子区总长度为1417bp，通过http：//www.urogene.org/cgi-bin/met在线软件预测285 ～ 910bp（共626bp）是一个CpG富含区域（CpG岛），位于第一外显子下游游用“+”表示，检测5端300bp左右区域，见图1。

1.2.3 BSP-测序 取受试者静脉血1mL，采用基因组DNA提取试剂盒（GENERAY，GK1022）抽提受试者外周血白细胞DNA，紫外分光光度法检测DNA纯度，置于-80℃冻存待用。应用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit（QIAGEN，cat：59824）按照说明

书进行DNA亚硫酸氢盐修饰处理，未甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐修饰后变为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶不改变。MethPrimer软件设计甲基化KCNJ11引物（见表1），引物由GENERAY公司合成。PCR扩增总体系50μL，加入经亚硫酸氢盐修饰的DNA模板2μL，2×PCR buffer 25μL，上下游引物各1μL，用双蒸水调整至终体积为50μL。PCR条件及设定反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，运行40个循环；72℃修复延伸5min结束反应。PCR产物以3%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，挑取阳性克隆送GENERAY公司测序。BSP扩增基因包含46个CpG位点，本研究设定原始系列中所有的CpG都是甲基化的，经亚硫酸氢盐修饰后KCNJ11修饰序列所有的CpG均不发生改变，以避免原始序列中的TG感染甲基化率，见图2。使用Vector NTI 8 软件对比序列，研究发现甲基化发生在第+62位、+66位、+351位3个CpG位点上，因此，以甲基化胞嘧啶（mC）克隆数目/10×100%计算个体甲基化率。

1.2.4 QPCR检测 用HiPure Blood/Liquid RNA Kit（Magen，R4163）提取外周血白细胞RNA，按Reverse Transcription System（Promega，A3500）试剂盒说明书进行逆转录。QPCR扩增总体系20μL，加cDNA模板1.5μL，GoTaq qPCR Master Mix （Promega，A6002）10μL，上下游引物（见表1）1μL，用双蒸水调整至终体积为20μL。PCR条件及设定反应程序：95℃预变性120s；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，运行40个循环。

1.3 统计学分析

符合正态分布的计量资料采用（）表示，组间比较采用t检测，mRNA相对定量结果比较用秩和检验，相关分析用Spearman相关分析。采用SPSS17.0统计学软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的临床特点

T2DM患者为单纯性新发患者，空腹血糖（11.62±3.64）mmol/L，HbA1C（10.15±2.69）%，空腹胰岛素（10.2±5.07）μU/mL，空腹C-肽（2.33±1.05）ng/mL。入组的15例T2DM患者与15例健康正常对照组比较，年龄及性别无显著差异。endprint

2.2 T2DM组与健康正常对照组KCNJ11启动子区甲基化位点及水平比较

两组出现甲基化的位点37个，2型糖尿组甲基化的位点是健康正常对照组的3.18倍，CpG+78、CpG+96、CpG+100、CpG+104、CpG+108、CpG+111、 CpG+121、 CpG+129、 CpG+132、CpG+136、CpG+141、CpG+168、CpG+174、CpG+178、CpG+201、CpG+210、CpG+215、 CpG+219、 CpG+223、CpG+233、CpG+248、CpG+268、CpG+270、CpG+272、CpG+288、CpG+324等26个位点的甲基化比率在2型糖尿病组的个别患者中有所升高，而在健康正常对照组却未出现甲基化，两组间总甲基化水平无明显差异（t=1.0323；P>0.05），各组均有甲基化的位点分别为CpG+62、CpG+66、CpG+351，见A图，该三个位点在正常组，甲基化比率分别为（58%±24%）、（46%±17%）、（96%±8.944%）；在2型糖尿病组分别为（60%±18%）、（41%±18%）、（99%±4%），正常组与2型糖尿病组的三个位点甲基化比率均无明显差异（t=0.2582，0.7821，1.1859；P>0.05），见B图。正常对照组mRNA与2型糖尿病组mRNA相对定量结果比较无明显差异（F=0.2534；P>0.05）。

2.3 KCNJ11基因启动子区甲基化与蛋白质表达的关系

直线回归分析显示，2型糖尿病组患者KCNJ11基因启动子区甲基化率高于健康正常组，而由KCNJ11基因编码内向整流型钾离子通道蛋白Kir6.2表达则低于健康正常组，甲基化程度与但标志表达呈显著负相关（r=-0.93，P<0.01）。

3 讨论

2型糖尿病为多基因遗传性复杂病[3]，目前对2型糖尿病的病因和发病机制仍然认识不足，是一组异质性疾病，占糖尿病发病的绝大部分，此类患者并未完全丧失产生胰岛素的能力，但胰岛素的作用效果较差[4]，其病因较为复杂，一方面胰岛素分泌相对不足，另一方面患者产生了胰岛素抵抗[5-6]。2型糖尿病的发病除了受到环境因素的影响外[7]，基因遗传因素的影响非常明显[8]。对于2型糖尿病的易感基因的研究中，KCNJ11一直是一个热点。KCN11基因编码内向整流钾通道Kir6.2亚基。Kir6.2亚基主要分布于胰岛β细胞，并与磺脲受体1共同组成β细胞ATP敏感的钾通道（K-ATP通道）[9]，该通道在胰岛素分泌和作用过程中扮演着十分重要的角色[10]，成为2型糖尿病发病机制中易感基因之一。目前有大量的研究[11-12]提示KCNJ11的基因突变是2型糖尿病发病机制之一，并把2型糖尿病发病机制的研究提升到表观遗传学水平，在国外Olsson AH等[13]报道，在对2型糖尿病患者胰岛细胞启动子甲基化的研究中，发现胰岛β细胞相关基因之一KCNJ11甲基化与胰岛β细胞mRNA表达呈负相关，在我国尚无相关报道。

本研究通过对我国新发2型糖尿病患者血液标本进行表观遗传学的研究，把2型糖尿病患者KCNJ11启动子区甲基化及其mRNA表达及与健康正常人群对比，发现2型糖尿病患者KCNJ11启动子区甲基化的位点明显增多，推测可能：（1）2型糖尿病患者启动子区的某些位点的甲基化水平变化可能影响胰岛β分泌胰岛素功能变化。（2）2型糖尿病患者KCNJ11启动子区的甲基化水平变化可能与该基因突变相关[14]。

综上所述，目前在糖尿病领域中，对于DNA甲基化的研究主要针对两个方面[15]：一方面是全基因组水平上扫描与糖尿病相关的差异DNA甲基化；另一方面是利用特异性引物对先前研究中已知功能的糖尿病相关基因进行差异DNA甲基化检测。本研究通过对2型糖尿病患者KCNJ11启动子区部分位点甲基化的状态，极大的促进了2型糖尿病发病机制在表观遗传学研究的发展，为今后2型糖尿病发病机制及新药[16]的研究提供了方向，然而是否存在其他相关基因位点的特异性甲基化与糖尿病的发生有关，仍尚待研究。本研究所用样本量较小，后续深入研究需采用较大的样本量。

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（收稿日期：2017-06-27）endprint