DNA甲基转移酶3B4过表达与肾透明细胞癌的关系*

2017-04-20张成海闫少春邹明新居红格

中国肿瘤临床 2017年6期

张成海闫少春邹明新居红格

张成海①④闫少春②邹明新③居红格④

目的：探究DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）发生发展中的机制。方法：收集2012年1月至12月15例内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院术前均未结予放化疗并行肾癌根治术患者的组织标本，均经病理证实为ccRCC。应用实时定量PCR、蛋白印迹、联合亚硫酸氢钠限制酶分析法和甲基化特异PCR等方法检测ccRCC组织中DNMT的mRNA表达，及ccRCC组织中整体甲基化（global methylation）水平和抑癌基因RASSF1A甲基化和表达水平。结果：ccRCC组织中DNMT3B4的mRNA表达增加，同时其蛋白含量也相应增加。ccRCC患者癌组织中DNA重复序列Alu的甲基化水平0.106±0.04较癌旁组织中0.115±0.03低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而肿瘤抑制基因RASSF1A启动子区域发生高甲基化，其mRNA和蛋白的表达均降低。结论：DNMT3B4基因过表达可能与染色体不稳定以及RASSF1A基因低表达有关，在ccRCC的发生发展中可能扮演着重要的角色。

肾透明细胞癌 DNA甲基转移酶 Alu RASSF1A

全世界每年确诊的成人恶性肿瘤中肾癌的发病率占2%～3%［1］。肾癌最常见的病理类型为肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC），其中肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）为最主要的一种类型，占RCC的60%～85%［2］。DNA甲基化主要是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）调控，有催化活性的DNMT又分为DNMT1、DNMT3A与DNMT3B。DNMT1在DNA复制过程中主要起到维持甲基化的作用，而DNMT3A与DNMT3B主要负责从头（de novo）甲基化来修饰未甲基化的DNA［3］。癌细胞中DNA发生异常甲基化，其DNMT的表达也往往发生异常。Robertson等［4］发现肿瘤中DNMT3B的表达显著增加，而DNMT1与DNMT3A只是轻微的增加。DNMT3B在不同类型肿瘤中的显著增加表明其在肿瘤的形成过程中扮演着重要的角色［5］。

通过对RCC中多基因甲基化分析发现，启动子区域发生甲基化常导致多个抑癌基因同时被沉默［6］。另有研究表明，在RCC中LINE-1与Alu重复序列的甲基化水平发生显著变化［7］。因此可见，DN⁃MT在RCC的DNA甲基化过程中起到了重要的作用。由于DNMT3B有近40种异构体，因此本研究旨在探讨DNMT3B异构体与ccRCC之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本收集2012年1月至12月内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院就诊的15例ccRCC患者的组织标本，患者年龄为38～75岁，所有患者术前均未予任何放化疗，均经病理证实为ccRCC。排除有严重的急性感染或同时患有其他肿瘤的患者。本研究经内蒙古科技大学包头医学院医学第一附属医院伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.1.2 主要试剂 DNA抽提试剂盒和Rnaeasy Mini Kit试剂盒（美国Qiagen公司），反转录SuperscriptⅢ试剂盒（美国Invitrogen公司），RIPA裂解液（杭州碧云天公司），BCA试剂盒（美国Pierce公司），抗DN⁃MT3B抗体（美国Novus公司），抗RASSF1A和抗βactin抗体（美国Abcam公司），DNA甲基化试剂盒（美国Zymo公司），Mbol I内切酶（大连Takara公司）。

1.2 方法

1.2.1 实时定量PCR 使用Rnaeasy Mini Kit提取总RNA，SuperscriptⅢ试剂盒逆转录总RNA成为cDNA，于-20℃保存备用，由上海生工生物工程有限公司进行引物合成，引物序列见表1。在7900型快速实时定量PCR检测型系统进行（美国，ABI公司）。各靶基因的CT值通过内参基因β-actin的CT值均一化，即△CT=CTtarget-CTβ-actin，各靶基因的相对丰度值以△△CT值表示，△△CT=2-ΔCT。

1.2.2 蛋白印记检测使用RIPA裂解液于冰上提取蛋白质，采用BCA法测定蛋白质含量，取40 μg的蛋白进行电泳。恒流30 mA电泳2 h，恒流400 mA冰浴中转膜3 h，10%脱脂奶粉封闭1 h，4℃摇床，分别孵育抗DNMT3B、抗RASSF1A和抗β-actin的一抗过夜，次日TBST洗膜后分别孵育相应的HRP标记的二抗1 h，再次TBST洗膜后曝光，并用ImageJ进行灰度分析。以β-actin为内参，统计蛋白印迹中各条带的相对丰度值。

1.2.3 基因整体甲基化水平检测重复序列Alu甲基化水平即代表基因整体甲基化水平。按照DNA抽提试剂盒提取癌组织与癌旁组织中基因组DNA，再按照DNA甲基化试剂盒说明书操作进行甲基化修饰。以甲基化的DNA作为模板，联合亚硫酸氢钠限制酶分析法（COBRA）分析Alu基因甲基化水平，PCR扩增Alu基因。Alu正向引物序列为5'-GATCTTTTTATTAAAAATA TAAAAATTAGT-3'；Alu反向引物序列为5'-GATCCCA AACTAAAATACAATAA-3'［8］。将扩增得到的PCR产物分别经10 U/μL Mbol I内切酶进行酶切，酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR扩增获得的目的条带通过Image J软件进行灰度值扫描及分析。Alu基因甲基化率=甲基化条带的灰度值/甲基化条带的灰度值+非甲基化条带的灰度值。

1.2.4 甲基化特异性PCR检测通过甲基化特异性PCR（MSPCR）检测15例ccRCC患者的癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因启动子区的甲基化状态。根据Greenspan等［9］报道设计MSPCR的引物和设置MSP⁃CR反应条件，并分别设置阳性和阴性对照。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，0.5 μg/mL的溴化乙锭染色，紫外凝胶分析仪观察并拍照保存。

1.3 统计学分析

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

表1 引物序列（续表1）Table 1 Primer sequence

2 结果

2.1 ccRCC患者的癌组织与癌旁组织中DNMT的mRNA表达

实时定量PCR实验结果显示，在ccRCC患者的癌组织与癌旁组织中DNMT1、DNMT3A与总DNMT3B的mRNA表达无显著性差异（P＞0.05），而DNMT3B4在癌组织中mRNA的表达水平高于癌旁组织（P＜0.05），其他DNMT3B异构体mRNA在ccRCC患者的癌组织与癌旁组织中表达未见显著性差异（P＞0.05，图1）。

图1 实时定量PCR检测肾透明细胞癌组织中DNMT3B4的mRNA表达Figure 1 Real-time PCR analysis of DNMT3B4 mRNA levels in ccRCC and adjacent normal tissues

2.2 ccRCC患者的癌组织与癌旁组织中DNMT3B4的蛋白表达

蛋白印迹检测15例ccRCC患者癌组织与癌旁组织中DNMT3B4的蛋白表达水平，结果显示5例患者的癌组织中DNMT3B4的蛋白阳性表达，而其癌旁组织中只有1例DNMT3B4的蛋白阳性表达（图2）。

2.3 ccRCC患者的癌组织与癌旁组织中基因整体甲基化变化

15例ccRCC患者的癌组织及癌旁组织中Alu基因的相对甲基化水平分别为0.106±0.04及0.115± 0.03，癌组织中Alu基因甲基化水平比癌旁组织低，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

2.4 ccRCC患者中RASSF1A的mRNA与蛋白表达

MSPCR法检测ccRCC患者中癌组织与癌旁组织中RASSF1A基因启动子区的甲基化率分别为（0.745± 0.11）%与（0.692±0.12）%，二者比较差异无统计学意义（P＞0.05，图4A、4B），但RASSF1A基因启动子区的甲基化水平轻微上调。实时定量PCR检测ccRCC患者癌组织与癌旁组织中RASSF1A基因的mRNA表达量。ccRCC癌组织与癌旁组织中RASSF1A的mRNA相对丰度值分别为0.032±0.009和0.0923±0.028，二者比较具有显著性差异（P＜0.05，图4C）。蛋白印迹检测RASSF1A蛋白分子量为39 kDa（图4D）。ccRCC相应组织和癌旁组织中RASSF1A蛋白对β-actin的相对丰度值分别为0.547± 0.099和0.105±0.0451（图4E），与癌旁组织相比，ccRCC蛋白的相对丰度值降低了2倍多，具有显著性差异（P＜0.05）。

图2 蛋白印迹检测ccRCC组织DNMT3B4的蛋白表达Figure 2 Western blot analysis of DNMT3B4 expression in ccRCC and adjacent normal tissues

图3 ccRCC组织中Alu序列甲基化水平分析Figure 3 Methylation of Alu sequences in both ccRCC and adjacent normal tissues

图4 ccRCC组织中RASSF1A表达及甲基化水平检测Figure 4 RASSF1A expression and methylation in ccRCC and adjacent normal tissues

3 讨论

DNA甲基化常以一些特定模式出现在癌细胞中，这种模式称为“DNA甲基化签名”，并作为许多癌症的标志物［10］。到目前为止，究竟是哪种DNMT导致RCC的DNA甲基化发生模式转变尚不清楚。本研究通过检测ccRCC癌组织与癌旁组织中DNMT1、DN⁃MT3A、DNMT3B以及DNMT3B六种异构体的mRNA表达水平发现，只有DNMT3B4的mRNA过表达，并发现DNMT3B4蛋白水平高表达，结果显示DNMT3B4过表达与ccRCC密切相关。因此，DNMT3B4过表达在ccRCC的发生发展中可能起着重要作用。

有关DNMT与DNA甲基化模式转变关系的报道结论不一。Ostler等［11］研究表明DNMT的转录表达与癌细胞中DNA的甲基化水平无关；但其他研究表明DNMT3B在不同类型肿瘤组织中过表达，并且对启动子区的异常甲基化起到重要作用［4，12-13］。结论的差异解释为有的研究检测某种特定异构体而有的研究检测总DNMT3B［12-13］。本研究发现，在ccRCC癌组织及癌旁组织中DNMT1、DNMT3A与总DNMT3B的mRNA的表达差异无统计学意义，而DNMT3B4的mRNA过表达。DNMT3B3是细胞中占主导地位的异构体［14］，DNMT3B有近40种异构体，如果只有一个或多个异构体发生改变，而且该异构体相对于DN⁃MT3B3的丰度值低，在ccRCC癌组织及癌旁组织中总DNMT3B的mRNA水平表达差异无统计学意义。本研究验证了DNMT3B4的mRNA相对丰度值与总DNMT3B的mRNA相对丰度值比例为1/1000，因此DNMT3B4过表达可能引起DNA甲基化模式的改变，进而导致肿瘤的发生。

目前，已经发现多种DNMT3B的异构体形式，DNMT3B异构体根据是否具有DNA甲基化转移酶活性分为有转移酶活性和无转移酶活性［3］两类。DN⁃MT3B4由于不含保守序列IX与X，导致其缺乏DNA甲基转移酶活性，该保守序列主要负责调控酶的活性，因此DNMT3B4主要对DNA甲基化起到负调控的作用。本研究发现ccRCC的重复序列Alu基因甲基化水平降低，DNMT3B4过表达能够诱导Alu等重复序列发生低甲基化而导致染色体不稳定，甚至发生重排继而导致肿瘤的发生发展。

DNMT3B4过表达也可能诱导抑癌基因发生高甲基化。Duymich等［15］认为，几乎所有的肿瘤细胞中均会出现DNA甲基化异常，该异常部分由具有转移酶活性的DNMT3B蛋白调节，而无转移酶活性的DN⁃MT3B异构体可能是作为调节蛋白发挥作用。但本研究并未发现RASSF1A基因启动子区甲基化在ccRCC癌组织与癌旁组织间的差异具有统计学意义，可能与本研究的样本例数较少有关。

总之，本研究通过检测ccRCC组织中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B以及DNMT3B的六种异构体表达发现，只有DNMT3B4过表达并可能引发DNA整体甲基化水平降低和抑癌基因RASSF1A甲基化变化，进而参与ccRCC的发生发展。

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（2016-12-15收稿）

（2017-03-22修回）

Relationship between the overexpression of DNA methyltransferase 3B4 and clear cell renal cell carcinoma

Chenghai ZHANG1,4,Shaochun YAN2,Mingxin ZOU3,Hongge JU4
1Department of Surgical Oncology,Inner Mongolia Bao Gang Hospital,Baotou 014010,China;2Biomedicine Research Center and Basic Medical Department,Baotou Medical College,Science and Technology University of Inner Mongolia,Baotou 014010,China;3Faculty of Biology Science and Technology,Baotou Teachers,College,Science and Technology University of Inner Mongolia,Baotou 014010,China;4Department of Pathology,First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Science and Technology University of Inner Mongolia,Baotou 014010,China

Mingxing ZOU;E-mail:zoumingxin@126.com

Objective:To determine the molecular role of DNA methyltransferase(DNMT)in kidney tumorigenesis.Methods:Tissue samples consisted of 15 cancer tissues and 15 matched adjacent tissues from clear cell renal cell carcinoma(ccRCC)patients who had undergone nephrectomy in 2012 at the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Science and Technology University of Inner Mongolia were collected.Real-time PCR,Western blot,combined bisulfite restriction analysis(COBRA)and methylation specific PCR were used in this study.Real-time PCR was used to examine the mRNA expression levels of DNMT.The global methylation level,DNA methylation level,and the expression of the antioncogene RASSF1A in ccRCC tissues were concurrently detected.Results:Both mRNA and protein levels of DNMT3B4,a splice variant of DNMT3B,were elevated in renal cell carcinoma tissue compared with those in control tissue.Additionally,Alu was hypomethylated in ccRCC tissue(0.106±0.04)compared with control tissue(0.115±0.03)(P＜0.05).Furthermore,the methylation of the promoter for RASSF1A,a tumor-suppressor gene,moderately increased in renal cell carcinoma tissue.By contrast,RASF1A expression decreased.Conclusion:DNMT3B4 overexpression may play an important role in human kidney tumorigenesis via chromosomal instability and the decreased expression of RASSF1A.

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