张丽杰龙欣欣肖培叶英楠刘芃芃于津浦

NTS/IL-8通路对肝细胞肝癌侵袭 迁移和EMT的影响*

张丽杰①龙欣欣①肖培①叶英楠②刘芃芃②于津浦①②

目的：探讨神经降压素（neurotensin，NTS）对肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞合成和分泌白细胞介素8（in⁃terleukin-8，IL-8）的影响及NTS/IL-8通路活化对HCC侵袭、迁移和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用。方法：通过慢病毒基因转染构建神经降压素受体1（neurotensin receptor1，NTR1）高表达的HCC细胞系Hep3BNTR1hi，利用小干扰RNA构建NTR1低表达HCC细胞系HepG2NTR1-。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附（ELISA）实验检测外源性NTS刺激前后HCC细胞IL-8分泌量的变化；利用划痕修复实验和Transwell实验观察阻断IL-8受体后HCC细胞侵袭迁移能力的变化；采用Western blot比较阻断IL-8受体后HCC细胞EMT相关蛋白的表达变化。结果：外源性NTS刺激和高表达NTR1可促进Hep3B和HepG2细胞合成和分泌IL-8（P均＜0.01），阻断或降低NTR1表达后IL-8的表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。外源性NTS刺激和高表达NTR1可提高HCC细胞的侵袭和迁移能力（P均＜0.05），阻断IL-8受体，即阻断NTS/IL-8信号下传，HCC细胞的划痕修复率和侵袭细胞数均降低（P均＜0.001），同时伴有E-cadherin表达增加，N-cadherin、β-catenin表达降低。结论：外源性NTS刺激和高表达NTR1可以刺激HCC细胞合成和分泌IL-8，阻断NTS/IL-8信号下传会降低肝癌细胞EMT和侵袭迁移能力。

神经降压素 白细胞介素-8 肝细胞肝癌 上皮间质转化

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前较为常见的恶性肿瘤之一，现已成为导致肿瘤相关性死亡的第二大病因［1］。尽管随着手术切除和介入治疗水平的不断提高，早期HCC患者的预后有所改善，但总体上HCC的复发和转移率仍居高不下。因此深入研究该过程中的关键因素及分子机制，有助于寻找更高效的治疗手段以改善HCC预后。

近年来，越来越多的研究证实上皮间质转化（ep⁃ithelial-mesenchymal transition，EMT）在HCC的发生、发展，尤其是肿瘤侵袭转移中发挥不可忽视的调节作用［2-3］。在EMT过程中，HCC细胞失去原有的上皮特征而获得间质细胞相关特征，进而导致肿瘤细胞侵袭及转移的增加［4］。本研究前期发现，神经降压素（neurotensin，NTS）可促进HCC细胞的侵袭、迁移和EMT，但详细的分子机制尚不明确［5］。NTS与其高亲和力受体神经降压素受体1（neurotensin receptor 1，NTR1）结合，可活化NF-κB途径、ERK途径和PKC途径而促进IL-8的释放，从而引起局部炎症反应，这一过程被称为NTS/IL-8通路［6］。有研究已证实NTS/ IL-8通路介导的炎症反应在结肠癌的发生发展中发挥重要作用［7］。因此，推测HCC细胞中NTS/IL-8通路可能通过促进EMT而促进肿瘤侵袭和转移，从而影响肝癌患者预后。本研究中将着重探讨NTS对HCC细胞中IL-8合成和分泌的影响及NTS/IL-8通路活化对HCC侵袭、迁移和EMT的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肝癌细胞株Hep3B、HepG2由本课题组保存，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。本课题组前期实验中对HCC的5种常见细胞系（MHCC97H、MHCC97L、Hep3B、7721和HepG2）的NTS及NTR1表达水平进行了相关检测，结果显示Hep3B中NTS表达水平高而NTR1水平较低；而HepG2细胞系中NTS水平稍低而NTR1水平高。因此选取这两种细胞系，通过慢病毒基因转染获得NTR1稳定高表达的Hep3BNTR1hi，利用小干扰RNA获得NTR1敲减的HepG2NTR1-细胞系［5］。本研究获天津医科大学肿瘤医院伦理委员会审查批准。

1.1.2 实验试剂 人IL-8包被的ELISA Kit（达科为公司）。兔抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）、β-连接素（βcatenin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）单克隆抗体以及羊抗兔二抗（美国ABcam公司）。NTS（美国Phoenix Pharmaceuticals公司）。Reparixin（IL-8受体CXCR1/2的抑制剂）、SR48692（NTS受体NTR1的拮抗剂）购自美国Sigma公司。细胞培养液DMEM（美国Hyclone公司）。胎牛血清（中国赛默飞公司）。Matrigel基质胶、Transwell培养板（美国BD公司）。

1.2.1 实时荧光定量 PCR 分别将 Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi、HepG2wt和HepG2NTR1-细胞以6×105个/孔接种于6孔板中，共分3个处理组：NTS处理组给予1μg/mL的NTS刺激；NTR1阻断组给予10 nmol/mL的SR48692抑制NTR1；NTS刺激和NTR1阻断共同处理组给予1 μg/mL的NTS和10 nmol/mL的SR48692处理，于37℃、5%CO2培养箱过夜培养。将上述不同处理的细胞用Trizol试剂提取总RNA，以此为模板行逆转录得总cDNA。采用实时荧光定量PCR（RT-qP⁃CR）法检测IL-8及内参β-actin的mRNA表达。

1.2.2 ELISA实验 收集上述不同处理组细胞的培养上清，按照酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒的操作说明，检测不同处理组细胞的培养上清中IL-8的表达。

1.2.3 划痕修复实验 将Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi和HepG2wt细胞以6×105个/孔接种于6孔板中，分别进行以下处理：NTS刺激组给予1 μg/mL的NTS刺激；IL-8受体阻断组给予0.2 nmol/mL的Reparixin阻断IL-8受体（CXCR1/2）的表达；IL-8受体阻断及NTS刺激组给予1 μg/mL的NTS和0.2 nmol/mL的Reparixin共同处理，过夜培养。至细胞融合率达80%，用20 μL枪头进行划痕，之后用PBS洗去划下细胞，换无血清培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。每12 h取样，拍照。

1.2.4 Transwell侵袭实验 将20～25 μL Matrigel基质胶（1 mg/mL）铺于Transwell小室底部，在Transwell下室加入含10%FBS培养基500 μL/孔，将Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi和HepG2wt细胞以2×104个/孔接种于上室，分别进行以下处理：NTS刺激组给予1 μg/mL的NTS刺激；IL-8受体阻断组给予0.2 nmol/mL的Reparixin处理；IL-8受体阻断及NTS刺激组同时给予1 μg/mL的NTS和0.2 nmol/mL的Reparixin处理，去血清培养48 h。95%乙醇固定30 min。结晶紫染色20 min，于倒置显微镜下观察穿过膜的细胞，计数。

1.2.5 Western blot检测 以6×105个/孔将Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi和HepG2wt细胞接种于6孔板中，NTS刺激组给予1 μg/mL的NTS刺激；IL-8受体阻断组给予0.2 nmol/mL的Reparixin处理；IL-8受体阻断及NTS刺激组同时给予1 μg/mL的NTS和0.2 nmol/mL的Reparixin处理，过夜培养。RIPA蛋白裂解液裂解细胞，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至PVDF膜上。5%BSA封闭1 h后，抗E-cadherin、β-catenin、N-cadherin（1:1 000）及抗内参β-actin（1:2 000）抗体4℃孵育过夜。TBST漂洗后，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:4 000）室温孵育1 h，TBST漂洗后，ECL显色曝光检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料用中位数（四分位数间距）表示，计数资料用±s表示，计量资料的比较用χ2检验，计数资料的比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外源性NTS和高表达NTR1对HCC细胞IL-8 mRNA表达的影响

采光顶钢结构周边为规则的弧形，内环也为规则的相近的弧形，凸起的内环靠下面的内环进行支撑。整个采光顶线条简明，造型新颖。

RT-qPCR结果表明，Hep3BNTR1hi细胞中IL-8的相对表达量为Hep3Bwt细胞的（5.36±1.17）倍（P＜0.01，图1A）。NTS刺激组的Hep3Bwt细胞IL-8的相对表达量为对照组的（2.89±1.18）倍（P＜0.01，图1A），且NTS刺激组的Hep3BNTR1hi细胞IL-8的相对表达量为对照组的（4.89±1.38）倍（P＜0.01，图1A）。

在HepG2细胞系中，HepG2NTR1-细胞中IL-8的相对表达量较HepG2wt细胞明显降低［（0.49±0.05）vs.（1.03±0.09），P＜0.05，图1B］。NTS刺激组的HepG2wt细胞较对照组IL-8的mRNA表达显著升高［（2.30± 0.22）vs.（1.03±0.09），P＜0.01，图1B］；并且NTS刺激组的HepG2NTR1-细胞中IL-8的表达为对照组的（1.58± 0.23）倍（P＜0.05，图1B）。

图1 外源性NTS对不同NTR1表达水平的HCC细胞系中IL-8（mRNA）表达的影响（RT-qPCR）；*P＜0.05，**P＜0.01Figure 1 Effect of exogenous NTS stimulation on IL-8 mRNA expression in HCC lines with different levels of NTR1(RT-qPCR)

2.2 外源性NTS和高表达NTR1对HCC细胞培养上清中IL-8分泌的影响

ELISA结果显示，Hep3Bwt细胞在NTS刺激前后，几乎不分泌IL-8；而Hep3BNTR1hi细胞较Hep3Bwt细胞IL-8分泌明显提高［（25.06±7.46）pg/mL vs.（0.56± 0.06）pg/mL，P=0.030，图2A］；并且NTS刺激组的Hep3BNTR1hi细胞和对照组相比，其IL-8分泌也显著升高［（162.40±22.88）pg/mL vs.（25.06±7.46）pg/mL，P= 0.005，图2A］。采用NTR1阻断剂SR48692阻断NTR1表达，观察到SR48692处理的Hep3BNTR1hi细胞较对照组IL-8分泌显著降低［（0.63±0.08）pg/mL vs.（25.06±7.46）pg/mL，P=0.031，图 2A］；且NTS和SR48692同时处理的Hep3BNTR1hi细胞的IL-8分泌较仅NTS刺激组明显降低［（3.00±1.16）pg/mL vs.（162.40±22.88）pg/mL，P=0.002，图2A］。

对于HepG2细胞系，敲减型HepG2NTR1-细胞与野生型HepG2wt细胞相比，降低NTR1表达量后，IL-8分泌显著降低［（173.30±12.02）pg/mL vs.（410.02±0.82）pg/mL，P=0.001，图2B］。NTS刺激组的HepG2wt较对照组IL-8的分泌明显上升［（666.70±8.82）pg/mL vs.（410.02±0.82）pg/mL，P=0.001，图2B］；且NTS刺激的HepG2NTR1-细胞较对照组IL-8分泌也有所增加［（216.70±8.82）pg/mL vs.（173.30±12.02）pg/mL，P= 0.043，图2B］。同样地，采用NTR1阻断剂SR48692阻断NTR1表达，结果表明SR48692处理后，HepG2wt细胞IL-8分泌明显降低［（41.67±4.41）pg/mL vs.（410.00±0.82）pg/mL，P=0.002，图2B］；并且NTS刺激的Hep3Bwt细胞IL-8分泌较SR48692处理前也明显降低［（78.33±4.41）pg/mL vs.（666.70±8.82）pg/mL，P= 0.005，图2B］。与此一致的是，SR48692处理后，HepG2NTR1-细胞较对照组IL-8分泌明显降低［（3.67± 0.88）pg/mL vs.（173.3±12.02）pg/mL，P=0.001，图2B］；且NTS刺激的HepG2NTR1-细胞IL-8分泌较SR48692处理前也显著降低［（11.33±1.86）pg/mL vs.（216.70± 8.82）pg/mL，P=0.003，图2B］。

2.3 阻断IL-8受体对NTS诱导的HCC细胞侵袭、迁移的影响

划痕修复实验结果显示Hep3BNTR1hi细胞的24 h划痕修复率和48 h划痕修复率较Hep3Bwt细胞均明显升高［（39.33±2.60）%vs.（28.00±1.53）%，P=0.020；（64.32± 2.08）%vs.（40.00±2.89）%，P=0.003，图3A］；NTS刺激的Hep3BNTR1hi细胞的24 h和48 h划痕修复率均高于对照组［（55.01±2.89）%vs.（39.33±2.60）%，P=0.016；（91.33± 1.86）%vs.（64.32±2.08）%，P＜0.001，图3A］。同时，IL-8受体阻断剂Reparixin处理的Hep3BNTR1hi细胞与对照组细胞相比，其24 h和48 h划痕修复率均明显下降［（21.00±2.08）%vs.（39.33±2.60）%，P＜0.001；（30.67±1.20）%vs.（64.32±2.08）%，P＜0.001，图3A］。同样，NTS刺激的Hep3BNTR1hi细胞在Reparixin处理24 h和48 h后，划痕修复率较对照组对照组细胞也显著下降［（27.07±1.73）% vs.（55.01±2.89）%，P＜0.001；（45.07±2.89）%vs.（91.33± 1.86）%，P＜0.001，图3A］，这些结果表明外源性NTS和高表达NTR1提高了Hep3B细胞的迁移能力，而阻断IL-8受体，即阻断NTS/IL-8信号下传，抑制了Hep3B细胞的迁移。

同样地，NTS刺激的HepG2wt细胞的24 h和48 h划痕修复率较对照组明显增加［（58.01±4.85）%vs.（37.67± 1.45）%，P=0.012；（94.03±2.33）%vs.（61.02±1.98）%，P＜0.001，图3B］；而Reparixin处理组的HepG2wt细胞的24 h和48 h划痕修复率较对照组明显降低［（21.33±1.86）% vs.（37.67±1.45）%，P＜0.001；（34.67±2.60）%vs.（61.02± 1.98）%，P＜0.001，图3B］；且NTS刺激的HepG2wt细胞在Reparixin处理24 h和48 h后，其划痕修复率较对照组细胞也显著下降［（35.07±2.89）%vs.（58.01±4.85）%，P= 0.021；（51.07±2.08）%vs.（94.03±2.33）%，P＜0.001，图3B］，这进一步证实NTS激活的IL-8信号的活化促进了HepG2细胞的迁移，而阻断IL-8受体，明显降低了HepG2细胞的迁移能力。

与划痕试验相对应的是，Transwell侵袭实验计数结果显示Hep3BNTR1hi细胞的侵袭细胞数较Hep3Bwt细胞明显增加［（92.00±4.13）vs.（53.33±4.41），P=0.003，图3C］；NTS处理的Hep3BNTR1hi细胞在侵袭细胞数目上较对照组也明显增加［（170.00±5.78）vs.（92.00± 4.13），P＜0.001，图3C］。并且，Transwell侵袭实验的结果也表明，Reparixin处理的Hep3BNTR1hi细胞的侵袭细胞数较Reparixin未处理组显著减少［（55.01±3.21）vs.（92.00±4.13），P=0.002，图3C］。NTS和Reparixin共同处理的Hep3BNTR1hi细胞的侵袭细胞数较仅NTS处理组也显著下降［（75.00±2.87）vs.（170.00±5.78），P=0.001，图3C］。同样地，NTS处理的HepG2wt细胞的侵袭细胞数较对照组明显增加［（166.70±5.74）vs.（100.00±5.74），P＜0.001，图3C］，而Reparixin处理组及NTS和Reparixin共同处理组的HepG2wt与对照组相比，其侵袭细胞数均显著减少［（50.01±2.87）vs.（100.00±5.74），P=0.001；（90.00±5.74）vs.（166.70± 5.74），P=0.002，图3D］。以上结果表明NTS刺激的IL-8信号的活化提高了HCC细胞的侵袭能力，而阻断IL-8受体，即阻断NTS/IL-8信号下传，则明显降低了HCC细胞的侵袭性。

2.4 阻断IL-8受体对NTS诱导的HCC细胞EMT的影响

Western blot结果显示，Hep3BNTR1hi细胞的EMT相关蛋白表达较Hep3Bwt细胞发生显著变化，其中E-cadherin表达明显降低，而N-cadherin、β-catenin表达均升高；NTS处理的Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi细胞与对照组相比，E-cadherin表达也降低，N-cadherin、βcatenin表达也明显升高。同时，Western blot结果也表明NTS和Reparixin共同处理组的Hep3BNTR1hi细胞与仅NTS处理组相比，EMT相关蛋白的表达也发生明显改变，其中E-cadherin的表达较对照组细胞明显升高，而N-cadherin、β-catenin表达均降低（图4）。

同样地，Western blot结果显示NTS处理的HepG2wt细胞与对照组相比，E-cadherin的表达明显降低，而N-cadherin、β-catenin表达均升高；然而，NTS和Reparixin共同处理的HepG2wt细胞与仅NTS处理组相比，EMT进程被逆转，其中上皮标志物E-cad⁃herin的表达明显上调，而N-cadherin、β-catenin表达均显著降低（图4）。

图2 外源性NTS对不同NTR1表达水平的HCC细胞培养上清中IL-8表达的影响（ELISA）；*P＜0.05，**P＜0.01Figure 2 Effect of exogenous NTS stimulation on IL-8 expression in HCC cell supernatants with different levels of NTR1(ELISA)

综上所述，外源性NTS和高表达NTR1可促进HCC细胞中IL-8的合成和分泌，并且NTS/IL-8信号的激活可促进HCC细胞发生EMT，提高HCC细胞的侵袭性，而抑制NTS/IL-8信号下传，则逆转了HCC细胞的EMT，进而抑制HCC细胞的侵袭和迁移。

图3 阻断IL-8受体对NTS诱导的HCC细胞侵袭性的影响Figure 3 Effects of IL-8 receptor blockade on NTS-induced tumor invasion

图4 阻断IL-8受体对NTS诱导的HCC细胞EMT的影响Figure 4 Effects of IL-8 receptor blockade on NTS-induced tumor EMT

3 讨论

研究已证实炎性微环境的形成对肿瘤细胞EMT的发生和HCC侵袭能力的增加起着重要的推动作用，其中肝炎病毒引起的慢性肝硬化在肿瘤EMT形成中的促进作用早有定论，但目前对于非病毒性炎性微环境在EMT和HCC侵袭转移中的作用尚不明确［8］。本课题组前期研究发现在HCC中，NTS高表达与多种炎症基因的过表达及EMT的活化密切相关［9］。NTS是由13个氨基酸组成的神经内分泌肽，近年的研究已证实NTS与结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤的生长和侵袭密切相关［10-14］。NTS不仅可以促进恶性肿瘤细胞增殖，还可以刺激炎症因子释放，促进局部炎症微环境形成［15］。其中NTS刺激炎症趋化因子IL-8分泌的过程，即NTS/IL-8通路已被证实与结肠癌转移及EMT过程密切相关［16，17］。但是目前关于肝癌中NTS/IL-8通路与EMT相关性的仍缺乏详细的研究报道。

生理状态下，IL-8是由单核巨噬细胞分泌的CXC型炎症趋化因子，近期的研究证实乳腺癌和结肠癌等恶性肿瘤中也存在IL-8的表达，并且IL-8信号可通过促进肿瘤细胞发生EMT来提高恶性细胞的侵袭性［18］。现阶段的研究已证实IL-8与HCC的进展和远处转移密切相关，但机制尚不清楚［19］。本课题组前期研究发现原代HCC组织中，NTS和IL-8蛋白表达呈显著正相关，且NTS和IL-8双阳性HCC标本中伴有典型的上皮标志E-cadherin丢失和胞浆内βcatenin堆积等EMT特征，提示HCC中可能存在NTS/ IL-8通路的异常活化，并与肝癌EMT进程显著相关［9］。因此，本研究着重在体外基因修饰的HCC细胞系中探讨NTS/IL-8通路及其对HCC侵袭、迁移和EMT的影响。

本研究利用慢病毒基因转染和小干扰RNA技术构建不同NTS易感性HCC细胞模型［5，20］，以研究外源性NTS对HCC细胞合成和分泌IL-8的影响，并进一步探究NTS/ IL-8通路活化在HCC细胞侵袭迁移和EMT中的作用。首先，采用慢病毒基因转染和小干扰RNA技术在体外构建NTR1稳定高表达的Hep3BNTR1hi细胞系及NTR1敲减的HepG2NTR1-细胞系，用超过HCC细胞自分泌水平的外源性NTS对细胞进行刺激，观察到外源性NTS刺激及NTR1的过表达可增加HCC细胞IL-8的合成和分泌。相反，阻断NTR1后，IL-8的合成和分泌则明显下降。这些结果表明NTS可通过与其受体NTR1结合促进IL-8的合成和分泌，即在HCC细胞存在NTS/IL-8通路的异常激活。同时，划痕修复实验和Transwell侵袭实验的结果表明外源性NTS和高表达NTR1促进了HCC细胞的侵袭和迁移，而采用CXCR1/2的抑制剂reparixin来阻断IL-8与受体的结合，即阻断NTS/IL-8信号下传，则观察到在阻断CXCR1/2表达后，HCC细胞的划痕修复率明显降低，并且侵袭细胞也显著减少，这表明NTS/IL-8通路的激活促进了HCC细胞的迁移和侵袭；同时在阻断CXCR1/2后，观察到EMT相关指标也发生明显变化，其中E-cadherin升高，而N-cadherin、β-catenin表达均降低。以上结果表明，NTS通过诱导IL-8的合成和分泌，继而通过促进HCC细胞发生EMT而提高肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。

本研究进一步证实了HCC细胞中存在NTS/IL-8信号通路的异常激活，并且证明NTS/IL-8通路可通过促进HCC细胞EMT而提高肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，从而为HCC的靶向治疗提供了有利的实验证据。

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（2016-10-10收稿）

（2017-02-18修回）

（编辑：周晓颖 校对：杨红欣）

Effects of NTS-induced IL-8 on invasion and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma

Lijie ZHANG1,Xinxin LONG1,Pei XIAO1,Yingnan YE2,Pengpeng LIU2,Jinpu YU1,2
1Department of Immunology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin 300060,China;2Cancer Molecular Diagnostic Center,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China

Jinpu Yu;E-mail:yujinpu@tjmuch.com

Objective:To determine the abnormal activation of the neurotensin(NTS)/interleukin-8(IL-8)pathway and its effect on invasion and epithelial–mesenchymal transition(EMT)in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:Hepatoma cell lines Hep3BNTR1hiand HepG2NTR1-were genetically modified by gene transfection or siRNA interference to establish various NTS-sensitive HCC cell lines bearing multiple levels of NTS receptor 1(NTR1).ELISA assay and real time RT-PCR were used to detect the difference of IL-8 protein secretion and RNA synthesis in varied NTS-sensitive Hep3B and HepG2 cell lines after exogenous NTS stimulation.The migration and invasion potentials of HCC cells were evaluated by scratch repair test and Transwell invasion assay.Western blot assay was used to detect the expression of EMT-related proteins in HCC cells with or without blocking IL-8 receptors.Results:Exogenous NTS stimulation and NTR1 overexpression enhanced the IL-8 RNA synthesis and protein secretion(P all＜0.01).Exogenous NTS stimulation and NTR1 overexpression also increased the invasion of HCC cells(P all＜0.05).Blocking IL-8 receptors reduced the wound closure rate,decreased the numbers of invasive cells,and reversed the EMT progress(P all＜0.001),including the up-regulation of E-cadherin and down-regulation of N-cadherin and β-catenin.Conclusion:In HCC cells,NTS stimulation and high expression of NTR1 induced the synthesis and secretion of IL-8,thereby promoting tumor EMT and HCC invasion.

neurotensin,interlukin-8,hepatocellular carcinoma,EMT

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.06.163

①天津医科大学肿瘤医院免疫室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室，天津市肿瘤防治重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心（天津市300060）；②肿瘤分子诊断中心

*本文课题受国家科技支撑计划课题（编号：2015BAI12B12和2015BAI12B15）、国家自然科学基金课题（编号：81272360和81472473）及天津市科技计划项目（编号：13ZCZCSY20300）资助

于津浦 yujinpu@tjmuch.com

This study was supported by the National Key Scientific and Technological Project of China(No.2015BAI12B12,2015BAI12B15),National Natural Science Foundation of China(No.81272360 and 1472473),and Scientific and Technological Project of Tianjin,China(No.13ZCZCSY20300)

张丽杰 专业方向为肿瘤免疫微环境的基础研究。

E-mail：zhanglj1108@foxmail.com