童春容

急性白血病免疫治疗的临床经验与前景

童春容

童春容教授，现任河北燕达陆道培医院血液科及免疫治疗科主任。兼任中国医药生物技术协会医药生物技术临床专业委员会常委，中国抗癌协会生物治疗专业委员会常委，中国医师协会检验医师分会血液肿瘤专业委员会副主任委员，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会委员，中华骨髓库专家委员会委员和《中国肿瘤生物治疗杂志》编委。擅长血液病整合诊治，恶性血液肿瘤的免疫治疗。

近年来，急性白血病（acute leukemia，AL）的免疫治疗已获得一些突破性进展。本文旨在总结AL免疫治疗的结果和经验，如抗CD19抗原嵌合受体基因工程修饰T细胞、抗CD3/19双特异抗体治疗，使部分难治复发急性B淋巴细胞白血病（refractory re⁃lapse acute B lymphocytic leukemia，r/r B-ALL）获得完全缓解（complete remission，CR）。本研究团队采用化疗联合自体细胞因子诱导的杀伤细胞、自然杀伤细胞，明显提高第一次CR期中低危险性AL的长期无病生存率（disease-free survival，DFS）。其他多种免疫治疗方法的研究也逐步开展，如针对其他靶点的抗原嵌合受体基因工程修饰T细胞、T细胞抗原受体基因修饰的T细胞，其他靶点的双特异性抗体、针对免疫细胞周期卡控点的抗体或药物等。多种免疫治疗及方法的联合有望提高AL的治愈率及生存质量，从而减少采用对生存质量影响更大的异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HCT）的治疗方法。

急性白血病 免疫治疗 临床结果 经验 前景

目前，治疗急性白血病（acute leukemia，AL）的主要方法是化疗、异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HCT），其他方法有靶向治疗、放疗、免疫治疗。放化疗、造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation， HCT）后白血病复发的主要原因之一是白血病细胞发生新的染色体及基因突变。因为放化疗是重要的诱变剂，所以不良反应较小的免疫治疗、靶向治疗等越来越受到关注。近年来，19-CAR-T、CD3/CD19双特异性抗体治疗r/r B-ALL获得突破性进展，其他多种免疫治疗方法也进入全面发展阶段。现将AL的免疫治疗方法、经验及展望综述如下。

1 过继性免疫细胞治疗

过继性免疫细胞治疗是指将自体或同种异体免疫效应细胞输注给患者，直接杀伤患者体内的AL细胞。由于AL一般需要反复化疗或HCT，且AL细胞主要占据骨髓及血液使正常免疫细胞大量减少；或免疫细胞本身是白血病细胞的起源细胞，其免疫功能往往低下。在此情况下，疫苗及非特异免疫刺激剂等需要激活体内免疫系统的方法很难在早期见效。因此，过继性免疫效应细胞治疗逐渐受到重视。Al⁃lo-HCT后输注同一供者的淋巴细胞（DLI）是防治Al⁃lo-HCT后AL复发的最常用且经济的过继性免疫治疗方法。迄今为止，CAR-T细胞是治疗r/r B-ALL见效较快、疗效较好的细胞。CIK、NK、抗原特异性细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）也在清除微小残留白血病（minimal residual disease，MRD），防止复发，提高治愈率上显示出疗效。

1.1 CAR-T

CAR-T是通过基因改造后获得靶抗原单克隆抗体单链可变区（scFv）的T细胞。目前，CAR-T的组成主要为：病毒基因载体将识别靶抗原的单抗单链可变区（scFv）、T细胞抗原受体穿膜部分及T细胞共刺激信号基因组合在一起，再转移给患者自身或同种异体的T细胞。2011年，美国宾夕法利亚州大学的研究团队首先报告采用抗CD19的CAR-T（19-CAR-T）治疗1例难治性慢性淋巴细胞白血病（chronic lym⁃phocytic leukemia，CLL）获得完全分子学缓解（com⁃plete molecular remission，CRm）［1］，这是首次采用免疫细胞治疗晚期白血病获得成功，此后CAR-T迅速成为热门研究方向。由于CD19是大部分B细胞肿瘤最稳定表达的抗原，且CD19几乎仅在B细胞上表达，攻击CD19导致的B细胞功能降低可以输注免疫球蛋白来弥补。因此，CD19-CAR-T是迄今为止报告最多、疗效最好，不良反应最低的CAR-T。19-CAR-T治疗r/r B-ALL疗效最好，完全缓解（complete remission，CR）率可达90%以上［2］，预估2017年美国食品药品监督管理局（FDA）会正式批准其临床应用。

2015年7月至2016年11月20日，本研究团队共采用慢病毒载体自体19-CD3ξ-41BB-CAR-T治疗55例原发耐药或难治性血液学复发患者［3-4］，治疗后92%（49/53）可评估患者获得CR或CRi（达到CR，但血细胞计数未完全恢复正常）。开展19-CAR-T治疗前2个月，2例死于治疗相关毒性（treatment related mortality，TRM），其中1例为脑出血，1例为持续白细胞严重低下后的重度感染，疗效不可评估；有6例患者发生≥3级的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），本研究团队考虑CRS的严重程度主要与患者体内白血病细胞负荷高，尤其是血液中白血病细胞比例高，输注的CAR-T细胞数有关；另有4例患者治疗未获得CR（NR），这4例均输注CAR-T细胞≤0.5×105/kg体质量，输注细胞前或输注后血液白血病细胞倍增太快，可能是无效的原因。

总结前期的经验和教训后，本研究团队近期连续治疗33例患者，选择标准为血液白血病细胞＜30%，头颅核磁共振检查颅内无肿块及其他严重病灶者，且回输CAR-T细胞均达到1×105/kg体质量；如果回输CAR-T细胞前血液白血病细胞绝对值成倍增长，先冻存CAR-T细胞，用化疗降低血液白血病细胞至＜1×109/L后再回输。最近随访，此33例患者均获得CR/CRi（100%），无1例死亡。采用19-CD3ξ-41BB-CAR-T先后治疗9例难治性流式细胞技术（flow cytometry，FCM）检测MRD阳性（FCM-MRD+）的患者，既往观察此类患者仅采用化疗全部复发，如果采用Allo-HCT，复发率高于FCM-MRD阴性者。19-CAR-T治疗后全部患者获得CRm（CR of molecular，CRm）；CRS均＜1级，无TRM，明显低于难治性血液性疾病复发患者。但是，19-CAR-T治疗CR后未移植者较多复发，且多为CD19阴性或弱阳性复发；CR后接受Allo-HCT者，80%以上获得CRm至今［5］。有研究显示，CAR-T获得CR后行Allo-HCT可明显改善长期无病生存率（disease free survival，DFS）［6］。因此，对r/r B-ALL，本研究团队建议在CAR-T治疗CR后1个月余，予以Allo-HCT达到治愈。本研究团队采用19-CAR-T细胞数明显低于国内外文献报告，可以明显降低治疗成本，有助于我国患者的应用；目前，国外采用CAR-T治疗成本及费用均较高，现阶段难以在我国广泛开展。19-CAR-T治疗的主要问题是CD19阴性或弱阳性者易复发，这可能是膜表面单靶点治疗难以克服的短板；如果患者在CAR-T治疗达CR后不能接受Allo-HCT（如年龄较高，无合适的供者，脏器功能太差等），可能需要加入其它的治疗，如靶向治疗、免疫治疗（CAR-T、TCR-T）等。CD22是B细胞肿瘤的另一个靶点。近期有研究采用22-CART治疗19-CAR-T后r/r B-ALL的CR率约为40%［7］。本研究团队已经采用慢病毒载体的22-CAR-T治疗3例19-CAR-T治疗无效或复发的患者，均获得CRi，不良反应与19-CAR-T相似，长期结果尚在观察中。由于CAR-T的杀伤作用很大，因此要求选择的靶点特异，主要在白血病细胞上，而不在重要细胞上。Ritchiel等［8］采用LeY-CAR-T细胞治疗5例急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）患者，3例有一定疗效，1例达到完全遗传学缓解，无严重并发症。123-CAR-T治疗浆母细胞样树突细胞肿瘤正在临床前研究中［9］。由于尚未发现很特异的靶点，目前对AML尚无更好的CAR-T治疗。

1.2 CIK

有研究提示，采用CD3单抗、白细胞介素2（inter⁃leukin 2，IL2）、γ干扰素（interferonγ，IFNγ）、IL1培养正常人外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte，PBL），称为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）［10］。本团队的研究显示培养后白血病患者自体CIK中各类T淋巴细胞的绝对值均增加（占90%以上），CD3+/CD8+/ CD56+NKT细胞增加倍数最高，也含有对自身白血病细胞特异性反应的CTL。迄今为止，本研究团队采用自体CIK联合化疗治疗300余例中低危险性化疗后获得第1次CR（CR1）期的AL患者，5年持续完全缓解（continous complete remission，CCR）概率比本研究团队相同危险分层仅接受化疗患者提高20%以上，可使部分MRD转阴［11-13］。供者来源CIK可防治Allo-HCT后白血病复发，对DLI无效者也有效，比DLI更安全，无严重GVHD发生，从而提高Allo-HCT对AL的治愈率［14］。

1.3 自然杀伤细胞（NK）

自然杀伤细胞（NK）在Allo-HCT后抗AML的作用较受肯定［15］。NK主要通过识别丢失自身的MHC-Ⅰ类分子的肿瘤或病毒感染细胞来识别并杀伤靶细胞。较多肿瘤细胞因MHC分子表达下降或丢失逃避T细胞攻击，而NK细胞可能有效。2005年美国明尼苏达大学的研究团队首次报道，在大剂量氟达拉滨+环磷酰胺后输注HLA半相同的异基因NK细胞治疗预后差的AML，NK在体内持续扩增（血＞50 NK/L持续12～16 d）的患者中30%AML获得CR［15］。本团队的临床研究也发现，部分采用化疗及自体CIK不能清除的MRD，用半相同NK可有效；AML在移植后复发，用DLI及CIK无效者，部分对NK仍有效，但是NK细胞对ALL的疗效较差［16］。NK细胞接触靶细胞是否能被激活，是激活及抑制性信号综合作用的结果，需要对供者NK受体与患者的配体进行筛查，据了解，美国M.D.安德森癌症中心（MDACC）通过筛选脐带血来选择适合患者的NK用于治疗。

2 抗体治疗

约20%B-ALL表达CD20，联合人鼠嵌合性CD20单抗及化疗治疗CD20+且＜60岁的B-ALL可提高总生存率［17］。近年来，获得突破性进展的抗体治疗是应用CD3/CD19双特异抗体（blinatumomab），治疗r/r B-ALL者43%获得CR或完全血液学缓解（complete hematologic remission，CHr），78%MRD阳性的B-ALL在1个疗程后获得CRm，被美国FDA快速批准上市。本研究团队采用blinatumomab先后治疗3例r/r B-ALL均获得CR，不良反应较小，但是价格较昂贵，不符合中国国情。与抗肿瘤抗生素结合的人源化CD33单抗（称为mylotarg或gemtuzumab ozogamicin，GO）已被批准用于治疗AML。多个临床试验显示，单用GO治疗复发AML的CR率约为30%，但因为不良反应较大，已经在美国退市。有研究提示，采用CD22单抗治疗19例B-ALL，67%的患者MRD转阴，且持续8个月，但是37%出现3～4级不良反应［18］，目前尚未被批准上市治疗B-ALL。CD3/22及针对AML的CD3/CD33双特异抗体尚在临床前研究阶段。

3 疫苗

疫苗治疗是指给予患者肿瘤抗原以激发其体内的特异性抗AL免疫反应。早年的肿瘤抗原多为放射线照射、其他方式灭活的自体/异体白血病细胞或细胞溶解物。近年来，蛋白、多肽或肿瘤抗原基因疫苗发展迅速，如WT1、PR3、PR1、MAGE-A1、MAGEA3、NY-ESO-1等，上述抗原也可以负载到抗原递呈细胞上；疫苗常常与免疫佐剂联合应用。Rosenblatt等［19］研究提示，采用自体白血病细胞与树突细胞融合的疫苗治疗17例CR期的AML患者，中位观察时间为57个月，12例持续CR。其他疫苗的病例数均较少，尚难得出明确结论。但是，因难以清除大量白血病细胞，疫苗主要用于CR期患者［20-21］。

4 非特异免疫调节剂及细胞因子

Coly's毒素（多种细菌毒素混合物）是最早采用的非特异免疫刺激剂，其他尚有卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌、细胞壁骨骼（CWS）、内毒素、脂多糖（LPS）、胸腺肽、多种佐剂等。目前，非特异免疫刺激剂主要以佐剂的形式与疫苗等联用，如琥珀酰化钥孔傶血兰蛋白（KLH）、不完全福氏佐剂、含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡脱氧核苷酸（CpGODN）、Toll样受体（TLR）拮抗剂等。佐剂可通过以下几个方面增强疫苗的作用：模仿炎症或细胞死亡信号吸引APC到达抗原注射部位，促进APC摄取抗原，诱导APC成熟以增加抗原的递呈，刺激T细胞，激活和扩增抗原特异性CTL或B细胞。部分细胞因子有增强免疫细胞功能及抗肿瘤增殖的作用。应用最多的是干扰素α（interferon α，IFNα）及IL2，但是多项研究未显示IFNa、IL2可提高AL的治愈率。部分细胞因子还可以作为佐剂联合疫苗应用，如IFN及粒单细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stim⁃ulating factor，GM-CSF）是最成功的佐剂。

5 消除体内的免疫抑制因素

很多研究显示，肿瘤细胞可通过多种机制诱导产生抑制自体免疫系统抗肿瘤作用的免疫细胞或因子，导致免疫治疗无效。美国国立癌症研究所（Na⁃tional Cancer Institute，NCI）领导的团队针对转移性黑色素瘤患者，先给予氟达拉滨及环磷酰胺治疗以降低体内的免疫抑制因素，再回输肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），明显提高了疗效。本研究团队的经验也显示先化疗再输注CIK、NK细胞比单独化疗或单独用CIK疗效好，如输注CAR-T前需要先用氟达拉滨及环磷酰胺才能有效。多种免疫治疗方法均与此方法联用以增强免疫治疗效果［20-21］。

6 小结

综上所述，免疫治疗的优势使之成为治愈AL最有希望的方法之一。在今后的工作中，亟需研究更多新的免疫治疗方法，如不诱导新的染色体及基因突变，可较特异性地攻击AL细胞而不伤害自身的正常细胞等，以期为AL免疫治疗提供新的方法和依据。

[1] Porter DL,levine BL,Kalos M,et al.Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia[J].N Engl J Med,2011, 365(8):725-733.

[2] Davila ML,Riviere I,Wang X,et al.Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia[J].Sci Transl Med,2014,6(224):224ra25.

[3] Pan J,Yang JF,Deng BP,et al.The highly clinical efficacy and safety of the autologous anti-cd19 chimeric antigen receptor t cells immunotherapy for 26 cases with heavily treated refractory b acute lymphoblastic leukemia[C].EHA Annual Meeting,2016:1483.

[4] Deng BP,Chang Alex Hongsheng,Yang JF,et al.Safety and efficacy of low dose CD19 targeted chimeric antigen receptor T(CAR-T)cell immunotherapy in 47 cases with relapsed refractory B-cell acute lymphoblastic leukemia(B-ALL)[C].ASH Annual Meeting,2016:649.

[5] Zhao YL,Wu T,Liu DY,et al.Immunotherapy with autologous anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells followed by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation has remarkably improved leukemia-free survival in refractory/relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia[C].ASH Annual Meeting,2016:829.

[6] Lee DW,Maryalice SS,Yuan CM,et al.Long-term outcomes following CD19 CAR-T cell therapy for B-ALL are superior in patients receiving a fludarabine/cyclophosphamide preparative regimen and post-CAR hematopoietic stem cell transplantation[C].ASH Annual Meeting,2016:218.

[7] Shah NN,Maryalice SS,Yuan CM,et al.Minimal residual disease negative complete remissions following anti-CD22 chimeric antigen receptor(CAR)in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia(ALL)[C].ASH Annual Meeting,2016:650.

[8] Ritchiel DS,Neeson PJ,Khot A,et al.Persistence and efficacy of second generation CAR-T cell against the LeY antigen in acute myeloid leukemia[J].Mole Ther,2013,21(11):2122-2129.

[9] Cai TY,Galetto R,Gouble A,et al.Pre-clinical studies of anti-CD123 CAR-T cells for the treatment of blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm(BPDCN)[C].ASH Annual Meeting,2016:4039.

[10]Tong CR,Hong B,Qiu JY,et al.Significance of cytogenetic and fluorescence in situ hybridization analysis in evaluating anti-chronic myeloid leukemia efficacy of different immune effectors cells[J]. Cancer Genetics and Cytogenetics,2002,134(1):21-24.

[11]Tong CR,Geng YB,Lu DP.Pilot report of the effect of auto-cytokine induced killers on the patientswith acute leukemia[J].J Peking Univer, 2002,32(5):473-475.[童春容,耿彦彪,陆道培.自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗治疗急性AL的临床研究[J].北京医科大学学报,2002, 32(5):473-475.]

[12]Zhang LP,Lu AD,Tong CR,et al.Treatment of minimal residual disease of childhood acute lymphoblastic leukemia by cytokine-induced killer/ interleukin-2[J].J Appl Clin Pediatr,2003,18(3):185-186.[张乐萍,陆爱东,童春容,等.细胞因子诱导的杀伤细胞/白细胞介素2治疗儿童急性淋巴细胞AL微小残留病疗效观察[J].实用儿科临床杂志,2003,18 (3):185-186.]

[13]Jiang H,Liu KY,Tong CR,et al.The efficacy of chemotherapy in combination with auto-cytokine-induced killer cells in acute leukemia [J].Chin J Intern Med,2005,44(3):198-210.[江 浩,刘开彦,童春容,等.化疗联合自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗AL的临床观察[J].中华内科杂志,2005,44(3):198-210.]

[14]Wang JB,Wu T,Yang JF,et al.Management of early leukemia relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation by donor's dendritic cell-prIMTed cytokine induced killer cells[C].ASH Annual Meeting,2008:829.

[15]Miller JS,Soignier Y,Panoskaltsis-Mortari A,et al.Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer[J].Blood,2005,105(8):3051-3057.

[16]Cao XY,Wu T,Deng BP,et al.Donor-derived ex-fivo activated NK cells in management of relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in high-risk acute leukemia[J].Blood,2014,124(21): 312.

[17]Jabbour E,Kantarjian H,Thomas D,et al.PhaseⅡstudy of The Hyper-CVAD regimen in combination with of atumumab as frontline therapy for adults with CD-20 positive acute lymphoblastic leukemia(ALL)[J].Blood,2013,122(21):2664-2674.

[18]Sasaki K,Jabbour EJ,O'Brien SM,et al.Inotuzumab ozogamicin in combination with low-intensity chemotherapy(mini-hyper-CVD)as frontline therapy for older patients with acute lymphoblastic leukemia(ALL):interim result of a phaseⅡclinical trial[C].ASH Annual Meeting,2016:588.

[19]Rosenblatt J,Stone RM,Uhl L,et al.Individualized vaccination of AML patients in remission is associated with induction of antileukemia immunity and prolonged remissions[J].Sci Transl Med,2016,8 (368):368ra171.

[20]Fu HH,Wang J,Fu J,et al.Tumor antigen vaccination of donors to augment graft-versus-tumor effects after allogeneic bone marrow transplantation with post-transplantation cyclophosphamide[C].ASH Annual Meeting,2016:499.

[21]Brayer J,Lancet JE,Powers JM,et al.WT1 vaccination in AML and MDS:a pilot trial with synthetic analog peptides[J].Am J Hematol, 2015,90(7):602-607.

（2016-12-28收稿）（2017-02-08修回）

（编辑：孙喜佳 校对：杨红欣）

Immunotherapy of acute leukemia:clinical experience and prospect

Chunrong TONG
Department of Blood Specialty,Hebei Yanda Lu Daopei Hospital,Langfang 065201,China

Chunrong TONG;E-mail:tongcr.21@163.com

Breakthroughs in the immunotherapy of acute leukemia have been achieved in recent years.The paper summarizes the clinical results,experience,and prospect in this area.One of the most significant advancements is the finding that anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells(CAR-T)or CD3/CD19 bispecific antibody increases the rate of complete remission in patients with refractory relapse acute B lymphocytic leukemia.The disease-free survival of patients with low or intermediate risk was dramatically improved by combining chemotherapy and adoptive cytokine-induced killer or natural killer cells.Many immunotherapy methods,such as those focusing on other targets of CAR-T,T-cell antigen receptor-modified T cell,and other targets of bispecific antibodies,are currently being examined.Combined methods can further increase cure rate and improve patients'quality of life,decreasing application of allogeneic hematopoietic cell transplantation which increases risks and reduces the quality of life.

acute leukemia,immunotherapy,clinical results,experience,prospect

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.06.475

河北燕达陆道培医院血液科（河北省廊坊市065201）

童春容 tongcr.21@163.com