毛西京　罗翔丹　于挺敏

[摘要] 目的 观察丁苯酞（NBP）对不同时间点血管性痴呆大鼠海马组织肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）表达的影响。方法 将80只健康Wistar大鼠按随机区组法分为血管性痴呆模型（VD）组、血管性痴呆模型+丁苯酞氯化钠注射液（NBP+VD）组、假手术+丁苯酞氯化钠注射液（NBP+Sham）组和假手术（Sham）组4个组，每组各20只。采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型。NBP+Sham组和NBP+VD组大鼠术后1 d开始给予丁苯酞氯化钠注射液腹腔注射，剂量为5 mg/（kg·d），Sham组和VD组大鼠给予生理盐水腹腔注射（0.2 mL/d），各组大鼠均连续腹腔注射给药7 d，每组按时间分为术后1周、2周、4周和8周4个亚组，于不同时间点断头取脑分离海马组织。采用ELISA方法检测海马组织TNF-α和IL-1β的表达。结果 术后1、2、4、8周，VD组大鼠海马组织TNF-α和IL-1β的表达均明显高于Sham组（P < 0.05）；术后8周，NBP+VD组大鼠海马组织TNF-α的表达明显低于VD组大鼠（P < 0.05）；VD组大鼠海马组织IL-1β的表达于2周时达到高峰期（P < 0.05）。 结论 VD大鼠海马组织TNF-α和IL-1β表达增加，NBP可通过降低VD大鼠海马组织TNF-α的水平从而发挥神经保护作用。

[关键词] 丁苯酞；血管性痴呆；海马；肿瘤坏死因子α；白介素1β

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（c）-0012-04

[Abstract] Objective To study the effects of 3-n-butylphthalide （NBP） on the expression of TNF-α and IL-1β at different time points in the hippocampus of vascular dementia rats. Methods A total of 80 Wistar rats were assigned to vascular dementia models （VD） group， vascular dementia models + NBP injection （NBP+VD） group， sham surgery + NBP injection （NBP+Sham） group and sham surgery （sham） group by randomized blocks， with 20 rats in each group. Vascular dementia rat model was established by ligating bilateral common carotid artery. The NBP+VD group and NBP+Sham group were intraperitoneally injected with NBP 5 mg/（kg·d）， VD group and Sham group were intraperitoneally injected with 0.2 mL/d saline for 7 days. Each group was divided into four subgroups （n=5） at 1， 2， 4 and 8 weeks after surgery. The rats in each group were decapitated to obtain brains at different time points， and hippocampus were isolated. TNF-α and IL-1β expressions in the hippocampus were determined by ELISA method. Results The expressions of TNF-α and IL-1β in the hippocampus of VD group were significantly higher than those of Sham group at each time point（P < 0.05）； the expression of TNF-α in the hippocampus of NBP+VD group was significantly lower than that of VD group at 8 weeks after surgery（P < 0.05）； the expression of IL-1β in the hippocampus of VD group reached peak level at 2 weeks after surgery. Conclusion The expression of TNF-α and IL-1β increase in the hippocampus of rats with vascular dementia. NBP may exert the protective effect by reducing TNF-α level in the hippocampus of vascular dementia rats.

[Key words] 3-n-butylphthalide； Vascular dementia； Hippocampus； Tumor necrosis factor-α； Interleukin-1β

丁苯酞（3-n-butylphthalide，NBP）是人工合成的消旋正丁基苯酞，作為临床用于治疗缺血性脑卒中的国家级一类新药，NBP能够明显减轻急性缺血性脑卒中患者中枢神经功能缺损[1]。随着对NBP研究的不断深入，目前发现NBP对血管性痴呆（vascular dementia，VD）也有较为明显的改善作用[2-3]，但其作用机制还缺乏深入的研究。临床研究观察到VD患者血浆中促炎细胞因子水平明显升高，并且促炎细胞因子水平与痴呆程度呈正相关[4]。Cunningham等[5]发现，脑组织中促炎细胞因子表达增加会加速痴呆的进展。TNF-α和IL-1β是两种重要的促炎细胞因子，脑缺血后海马中TNF-α和IL-1β表达增加与VD发生密切相关[6]。本研究在制备VD大鼠模型的基础上，应用NBP给予干预治疗，观察不同时间点VD模型大鼠海马组织TNF-α和IL-1β表达变化，进而探讨NBP对VD的保护作用，为临床应用NBP治疗VD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器

80只健康SPF级Wistar大鼠（雌雄各半），体重200～220 g，购于吉林大学基础医学院动物中心，动物合格证号：SCXK（吉）2003-001。丁苯酞氯化钠注射液（石药集团恩必普药业有限公司，批准文号：国药准字H20100041）。大鼠TNF-α酶联免疫检测试剂盒和大鼠IL-1β酶联免疫检测试剂盒购自北京绿源博德生物科技有限公司。酶标仪（ELX800，美国Bio-Tek公司）。

1.2 实验动物分组

大鼠饲养于吉林大学第二医院动物实验室，室内温度22～26℃，相对湿度40%～60%，光暗周期12 h，自由摄取食物和水，动物模型制备前适应性喂养7 d。按随机区组法分为血管性痴呆模型（VD）组、血管性痴呆模型+丁苯酞氯化钠注射液（NBP+VD）组、假手术+丁苯酞氯化钠注射液（NBP+Sham）组和假手术（Sham）组4个组，每组20只；再将各组按时间分为术后1周、2周、4周和8周4个亚组，每个亚组5只。

1.3 动物模型制备

采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型，具体操作如下：

VD组和NBP+VD组大鼠术前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于操作台，常规消毒颈部手术区域，颈前正中作一长约1 cm的纵形切口，钝性逐层分离皮下软组织、颈前肌群，分离出气管侧后方的颈动脉鞘，进而分离颈总动脉与迷走神经，以1号丝线永久结扎颈总动脉，同法结扎另一侧颈总动脉。局部消毒后恢复组织层次并缝合皮肤。Sham组和NBP+Sham组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外，其余操作与VD组和NBP+VD组大鼠一致。术后动物另放于干净鼠笼饲养，自由获取水源及饲料。

1.4 药物干预

NBP+Sham组和NBP+VD组大鼠清醒后（术后1 d，可在笼中自由活动），给予丁苯酞氯化钠注射液腹腔注射，剂量为5 mg/（kg·d）（药物剂量根据成人常规每日剂量进行换算），Sham组和VD组大鼠给予生理盐水腹腔注射（0.2 mL/d）。各组大鼠连续腹腔注射给药7 d。

1.5 标本采集及检测指标

各组大鼠在术后各时间点（1、2、4、8周），给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（麻醉剂量：0.3 mL/100 g），生理盐水心脏灌注5 min，断头取脑，分离双侧海马，-70℃保存备用。用ELISA法检测各组大鼠海马组织中TNF-α和IL-1β水平，按试剂盒说明书进行实验操作，根据标准品的浓度及对应的吸光度（A）值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析和Tukey检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马组织TNF-α的表达比较

不同时间点，各组大鼠海马组织TNF-α的表达比较：①术后1、2、4、8周，VD组大鼠海马组织TNF-α的含量明显高于Sham组（P < 0.05）；②术后1、2周，NBP+VD组大鼠海马组织TNF-α的含量明显高于Sham组（P < 0.05）；③术后8周，NBP+VD组大鼠海马组织TNF-α的含量明显低于VD组大鼠（P < 0.05）。

不同组别大鼠各时间点海马组织TNF-α的表達比较：术后1、2、4、8周，四组大鼠海马组织TNF-α的含量结果比较，差异均无统计学意义（P ﹥ 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠海马组织IL-1β的表达比较

不同时间点，各组大鼠海马组织IL-1β的表达比较：术后1、2、4、8周，VD组和NBP+VD组大鼠海马组织IL-1β的含量明显高于Sham组（P < 0.05）。

不同组别大鼠各时间点海马组织IL-1β的表达比较：①VD组大鼠2周时海马组织IL-1β的含量明显高于术后1、4、8周（P < 0.05）；术后1、4、8周时海马组织IL-1β的含量无显著性差异（P﹥0.05）。②NBP+VD组大鼠术后4、8周时海马组织IL-1β的含量明显低于术后1、2周（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

炎性损伤是VD的一个重要病理机制，脑缺血损伤引起多种炎性因子上调，如细胞间粘附分子1、环氧合酶-2（COX-2）、一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-1β等[7-8]，这些炎性因子可以激活小胶质细胞和星形胶质细胞，激活的胶质细胞又进一步释放多种细胞因子和有毒介质，造成神经元的损伤，并且可以破坏血脑屏障，血脑屏障的破坏又会增强炎性反应，造成继发性的脑损害[9-11]。临床研究发现：VD病人血清IL-6明显高于正常人群[12]；多梗死性痴呆患者脑脊液中TNF-α含量明显高于对照组，因此认为多梗死性痴呆患者的中枢神经系统炎性应答机制被激活，并且与病情的严重程度呈正相关[13]。动物实验发现：VD大鼠脑脊液和血清中IL-6含量明显升高，且IL-6含量越高，模型大鼠记忆学习能力越差[14]。脑组织缺血及缺血再灌注时，神经元、内皮细胞等被激活，释放两种重要的炎性因子TNF-α和IL-1β，进而刺激其他细胞因子的释放，形成级联反应，激活粒细胞、单核-吞噬细胞等，造成炎性反应损伤神经元[15]；诱导血管活性物质的异常释放，导致血管收缩、脑血流量进一步降低，加重脑缺血损伤[16]。炎性因子不仅影响神经元的存活，还可以调节突触可塑性，参与VD发病[17-18]。有研究发现，脑缺血后海马中TNF-α和IL-1β表达增加与VD发生密切相关[6，17]。

TNF-α能够影响星形胶质细胞、巨噬细胞和小胶质细胞的功能，导致细胞增殖、细胞外基质重塑[19]；激活核转录因子（NF-κB）进而引起星形胶质细胞释放促炎细胞因子[20]；促使小胶质细胞和星形胶质细胞释放兴奋性神经递质（如谷氨酸），并且抑制星形胶质细胞再摄取谷氨酸，导致胞外谷氨酸水平持续增高，增加神经毒性作用，引起细胞因子、毒性介质的积累，诱导神经元死亡[21]。TNF-α还可以上调神经元的谷氨酸受体，并促进神经元和胶质细胞表达不规则趋化因子（Fractalkine），Fractalkine与其受体结合诱导黏附、趋化和激活其他炎性细胞，造成神经元损伤[22]。本实验发现：VD组大鼠1、2、4、8周时海马组织TNF-α的含量均明显高于Sham组，证实海马组织TNF-α异常增加参与了血管性痴呆的病理过程。术后8周，NBP+VD组大鼠海马组织TNF-α的含量明显低于VD组大鼠（P < 0.05），提示NBP可以抑制脑缺血恢复期海马组织TNF-α的过度表达，从而减弱因TNF-α引起的神经损害，发挥神经保护作用。

尽管IL-1β可能并不直接毒害神经细胞，但IL-1β可以激活星形胶质细胞，通过NF-κB途径促使胶质细胞释放TNF-α和iNOs（iNOS可产生NO），NO对神经细胞具有直接毒性，并且可以增加血脑屏障的通透性[23-24]。IL-1β还可以诱导星形胶质细胞表达ICAM-1、MCP-1等，促进单核细胞在中枢神经系统的浸润，加重神经炎性反应，造成神经损伤[25]。本研究发现，VD组大鼠术后1、2、4、8周时海马组织IL-1β含量均明显高于Sham组，证实海马组织IL-1β参与了血管性痴呆的病理过程。VD组大鼠2周时海马组织IL-1β的含量明显高于1、4、8周；提示IL-1β过表达在脑缺血2周时达到高峰。术后个时间点，NBP+VD组大鼠海马组织IL-1β的含量与VD组大鼠相比均未发现明显差异，提示NBP可能并不能影响VD大鼠海马组织IL-1β的过度表达。

综上所述，TNF-α和IL-1β表达增加参与了VD病理过程，其中IL-1β过表達在脑缺血2周时达到高峰。NBP可以抑制脑缺血恢复期海马组织TNF-α的过度表达，减弱TNF-α引起的神经损害，发挥神经保护作用，而NBP可能不影响VD大鼠海马组织IL-1β的过度表达。

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（收稿日期：2016-10-17 本文编辑：李岳泽）