尹　　鑫，于海龙，张晓峰，赵静怡，杨　　丽，周　　健

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德　067000）

当羊骨片对维甲酸致骨质疏松大鼠股骨OPG/RANKL mRNA表达的影响*

尹鑫，于海龙，张晓峰△，赵静怡，杨丽，周健

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德067000）

目的：观察当羊骨片对维甲酸致骨质疏松大鼠股骨骨保护素（OPG）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）mRNA表达的影响。方法：6月龄雌性SD大鼠60只，随机分为正常对照组、维甲酸模型组、仙灵骨葆组（312mg/kg）和当羊骨片低、中、高剂量组（250、500、1000mg/kg），每组10只。维甲酸灌胃建立骨质疏松大鼠模型，各用药组大鼠灌胃给予相应剂量的药物。RT-PCR法检测股骨上段OPG、RANKL mRNA的表达。结果：当羊骨片中、高剂量能显著升高模型大鼠股骨OPG mRNA表达（P＜0.01），降低模型大鼠股骨RANKL mRNA表达及RANKL/OPG比值（P＜0.01）。结论：当羊骨片可能通过调控OPG、RANKL基因表达，对维甲酸致骨质疏松大鼠有一定的保护作用。

骨质疏松；维甲酸；当羊骨片；OPG；RANKL

骨质疏松症（OP）是一种以骨量低、骨骼显微结构退化为特征，骨组织脆性和骨折风险度增加的全身性骨骼系统疾病，属于中医学“骨痿”、“骨痹”等范畴［1］。OPG/RANK/ RANKL系统作为破骨细胞成熟分化及骨吸收调节的关键通路，已被证实是防治OP的重要途径［2］。本研究通过观察复方制剂当羊骨片对维甲酸致骨质疏松大鼠骨组织OPG、RANKL基因表达的影响，为当羊骨片的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器当羊骨片（承德医学院中药研究所），仙灵骨葆胶囊（贵州同济堂制药有限公司），维甲酸（北京贝丽莱斯生物化学有限公司），RT试剂盒（北京天根生化科技有限公司），梯度PCR仪（BIO-RAD）。

1.2实验动物分组与造模6月龄SPF级雌性SD大鼠60只，体质量（280±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001。大鼠机分为正常对照组、维甲酸模型组、仙灵骨葆组（312mg/kg）和当羊骨片低、中、高剂量组（250、500、1000mg/kg），每组10只。除正常对照组，其余各组动物连续灌胃维甲酸（70mg/kg）14d，建立大鼠骨质疏松模型［3-4］。造模的同时，各组大鼠灌胃给予相应剂量的药物；正常对照组、模型组大鼠给予同体积的蒸馏水。维甲酸灌胃结束后，继续给药14d，共给药28d。给药结束后处死大鼠，迅速取大鼠左侧股骨上段，去除筋膜，生理盐水清洗，滤纸吸干表面水分，速冻后，-80℃保存。

1.3RT-PCR法检测股骨OPG、RANKL mRNA表达取50-100mg股骨，置于盛有液氮的研钵内研磨至组织成白色粉末状后迅速转入匀浆器内（研磨过程中液氮始终没过组织），Trizol法提取总RNA，并反转录成cDNA［5］。PCR引物序列：GAPD H（332bp）：F：5’-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’，R：5’-GTGCTGAGTATCGTGGAG-3’， OPG（631bp）：F：5’-TGGAGCTCGAATTCTGCTTG-3’，R：5’- CATCAAGATGCGGAGCTGCT-3’，RANKL（810bp）：F：5’-CGTACCT GCGCGGACTATCTCA-3’，R：5，- GTTGGACACCTGGACGCTAA-3’。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，第2步起循环。取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（90V，40min）。应用Gel pro32软件进行分析，以目的条带吸光度与GAPDH条带吸光度的比值，作为目的基因mRNA的相对表达水平。

1.4统计分析采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与正常对照组比较， 模型组大鼠股骨RANKL mRNA表达及RANKL/OPG比值显著升高（P＜0.01），OPG mRNA表达显著下降（P ＜ 0.01）；与模型组比较，仙灵骨葆组，当羊骨片中、高剂量组大鼠股骨RANKL mRNA表达、RANKL/OPG比值显著降低（P＜0.01），OPG mRNA表达显著升高（P＜ 0.01）。见附表，附图。

附表　各组大鼠股骨OPG和RANKL mRNA表达及RANKL/OPG（n=10，n=6±s ）

附表　各组大鼠股骨OPG和RANKL mRNA表达及RANKL/OPG（n=10，n=6±s ）

与正常对照组比较：aP＜0.01；与模型组比较：bP＜0.01

组别　OPG mRNA　RANKL mRNA　RANKL/OPG正常对照组　1.281±0.119　0.985±0.037　0.773±0.057模型组　0.464±0.025a　1.218±0.040a　2.624±0.081a仙灵骨葆组　0.880±0.091b　0.717±0.048b　0.819±0.090b当羊骨片低剂量组　0.509±0.040　1.031±0.069b　2.038±0.269当羊骨片中剂量组　0.631±0.042b　0.632±0.025b　1.005±0.103b当羊骨片高剂量组　0.659±0.045b　0.555±0.044b　0.841±0.030b

中医学认为，骨质疏松症（OP）的病位在肾，与肝、脾有关，以虚为本，以淤为标［6］。在治疗上，主要以补肾、健脾、活血为主。当羊骨片是由淫羊藿、补骨脂、当归组成的中药复方制剂。淫羊藿为主药，温补肾阳；补骨脂为辅药，补肾填精，温补脾肾；当归，益气养血，祛瘀止痛。这三味中药都具有植物雌激素作用，能促进骨组织蛋白合成及成骨细胞生成。研究发现，淫羊藿能上调成骨细胞中OPG mRNA的表达及OPG/RANKL比值，抑制RANKL mRNA的表达和过度骨吸收［7］。补骨脂能增强成骨细胞

附图　大鼠股骨OPG mRNA和RANKL mRNA表达

3 讨论

OPG mRNA的表达，下调RANKL mRNA的表达，从而抑制破骨细胞的分化、成熟和骨吸收，达到防治骨质疏松的目的［8］。当归能增强雌激素合成，减少下丘脑神经递质释放，提高超氧化物歧化酶的活性［9］。

骨质疏松具有破骨作用显著增强的特点，而破骨作用主要取决于破骨细胞的分化与成熟。RANKL通过与破骨细胞表面的核因子κB受体活化因子（RANK）结合促进破骨细胞的活化成熟。OPG能竞争性抑制RANK和RANKL的结合从而阻止破骨细胞的分化，达到抑制骨吸收的目的，同时，干扰骨髓基质细胞与破骨细胞之间的作用诱导破骨细胞凋亡［10］。OPG无直接传接信号的能力，必须通过与RANKL结合发挥抑制骨吸收的作用。因此，破骨细胞的分化成熟主要取决于RANKL与OPG的相对量［11］。如果RANKL/OPG比值升高，破骨细胞的数量与活性增加，从而导致骨质疏松；相反，破骨细胞活性降低，成骨能力增强而使骨质硬化。

本研究显示，与模型组比较，当羊骨片中、高剂量组大鼠股骨OPG mRNA表达显著升高，RANKL mRNA表达、RANKL/OPG比值显著下降，提示当羊骨片可能通过刺激成骨细胞和骨髓基质细胞分泌OPG，使RANKL与RANK结合减少，从而降低破骨细胞活性，减少骨吸收。综上所述，当羊骨片可能通过调控OPG、RANKL基因表达，对维甲酸致骨质疏松大鼠有一定的保护作用。

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EFFECTS OF DANGYANGGU TABLET ON OPG/RANKL MRNA EXPRESSION IN FEMUR OF OSTEOPOROSIS RATS INDUCED BY RETINOIC ACID

YIN Xin， YU Hai-long， ZHANG Xiao-feng ， et al
(Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Hebei Chengde 067000,China)

Objective： To observe the effects of Dangyanggu tablet on osteoprotegerin （OPG） and receptor activator of NF-κB ligand （RANKL） mRNA expression in femur of osteoporosis rats induced by retinoic acid. Methods: 60 female SD rats were randomly divided into control group， model group， Xianling Gubao capsule group （312mg/kg） ， Dangyanggutablet lower， middle and high dose （250， 500， 1000 mg/kg） group with 10 rats in each group. The osteoporosis rats’ model was established by lavaging with retinoic acid； and then the rats in each drug group were lavaged with corresponding drugs. RT-PCR was used to detect the OPG and RANKL mRNA expression in femur. Results: Middle and high dose Dangyanggu tablet could obviously increase OPG mRNA expression in femur of model rats， but obviously decrease RANKL mRNA expression and RANKL/OPG of model rats （P＜0.01）. Conclusions: Dangyanggu tablet has certain protective effects on retinoic acid induced osteoporosis rats by regulating OPG and RANKL gene expression.

Osteoporosis； Retinoic acid； Dangyanggu tablet； OPG； RANKL

R285.5

A

1004-6879（2016）05-0363-03

* 河北省重大技术创新项目（07276444Z）

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（2016-03-18）