张雪，韩丽娟，陈莉霞，侯生珍，桂林生，王志有，杨葆春

（青海大学农牧学院，青海 西宁 810016）

黑藏羊是青藏高原地区具有特殊养殖效益和经济价值的藏羊品种之一[1]。黑藏羊主要产自青海省贵南县，并于2017年5月被纳入中国国家地理标志产品。随着人们健康意识的提高，黑藏羊肉因其脂肪含量低、蛋白质含量高、矿物质和维生素种类丰富、氨基酸和脂肪酸营养价值高、适口性好、香气浓郁、膻味小等优点而备受消费者的青睐[2]。羊骨作为黑藏羊屠宰后主要副产物，占黑藏羊肉总量20%～30%[3]，羊骨资源极为丰富，但目前黑藏羊骨大部分被用作粗饲料或随意丢弃，没有进行深度加工和利用，造成了严重的资源浪费和环境污染[4]。

大量研究表明，畜骨具有很高的营养价值，可以预防各种营养不足[5]。畜骨中含有骨胶、生长素、氨基酸等人体所需的营养物质，且其蛋白质和脂肪含量可与鲜肉媲美。畜骨在产品加工利用方面也具有较大的前景。畜骨中的蛋白质通过酶法水解后可用来生产混合胶原肽；骨髓中的骨髓油可用来开发各类辅料，如软胶囊壁材、药材黏合剂等；此外畜骨还可作为生物活性钙源，目前使用比较广泛的骨钙产品有超细骨粉、胶原多肽钙和骨钙粉等[6]。

目前国内外对于畜骨的研究多集中于牛骨营养价值分析。李享等[7]的研究结果表明牦牛骨的营养品质比西门塔尔牛骨更好，为牦牛骨资源利用和精深加工提供了依据。吴婷等[8]研究5个不同品种牛骨营养组成，为牛骨进一步开发利用提供了依据。Mello等[9]对牛骨髓的脂质进行分析，为开发高附加值牛骨产品奠定了基础；张晋华等[10]明确羊驼骨的成分特点和利用价值，为合理开发羊驼骨资源提供了理论依据。然而，目前对藏羊骨尤其是黑藏羊骨营养品质和产品开发的研究鲜有报道，其关于营养品质的数据十分匮乏，不利于今后黑藏羊骨资源的深入开发。因此，本研究通过对黑藏羊骨的营养价值进行分析，并与湖羊骨的营养品质进行比较，为黑藏羊骨的资源化利用和高值化产品开发提供理论依据，这对提高黑藏羊产业的综合效益也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑藏羊骨（肱骨）：采自青海省贵南县；湖羊骨（肱骨）：采自青海省共和县。两种羊骨随机选取于健康无病且月龄相同的黑藏公羊（6只）和湖公羊（6只），于温度-20℃冷冻贮存。

石油醚：天津欧博凯化工有限公司；酒石酸钾钠：天津市河东区红岩试剂厂；甲基红：天津市永大化学试剂有限公司；溴甲酚绿：上海展云化工有限公司。以上试剂均为分析纯。甲酸（色谱纯）：美国Fluka公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：德国Merck公司；正己烷（优级纯）：国药集团；氯仿（优级纯）：上海沃凯化学试剂有限公司；牛血清蛋白：南京都莱生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DC-305高速多功能粉碎机：浙江武义鼎藏日用金属制品厂；SX2-8-10马弗炉：长沙市华光电炉厂；K9840自动凯氏定氮仪、SOX406脂肪测定仪：山东海能科学仪器有限公司；CT3-10K质构仪：美国Brookfield公司；U/V-1780紫外可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；5500 QTRAP质谱仪：美国AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪、7890/5975C气相质谱联用仪：美国Agilent公司；5430R低温高速离心机：德国Eppendorf公司；H1650-W冷冻离心机：湖南湘仪离心机有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理

在4℃下解冻羊骨12 h，剔除羊骨表面肌肉、脂肪、骨连接处结缔组织及骨髓后，清水洗净、沥干水分，破碎成块后用高速多功能粉碎机破碎成粉过80目筛，密封后于-80℃保存备用[11]。

1.3.2 羊骨硬度测定

参考刘建华等[12]方法，采用质构仪进行样品硬度测定。探头选用HDP/BS，测试前速度为1.5 mm/s，测试速度为2.0 mm/s，测试后速度为10.0 mm/s，触发力为5 g。记录峰值读数，单位为g。

1.3.3 基本营养成分含量测定

水分含量参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法进行测定[13]；灰分含量参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中的马弗炉高温灼烧法进行测定[14]；粗蛋白含量参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定[15]；粗脂肪含量参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的索氏提取法进行测定[16]。

1.3.4 多肽含量测定

参照陈学红等[17]的方法并作修改。制作牛血清蛋白标准曲线，得到线性回归方程y=0.058 4x-0.002 4，R2=0.998 4。

参照陈学红等[17]和何荣海等[18]的方法，将骨粉配制成0.4 mg/mL的水溶液。取骨粉水溶液与10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）水溶液混合（1∶1，体积比），振荡、10 000 r/min离心10 min除去蛋白后，用5%TCA再次去除蛋白。取上清液与双缩脲试剂混合（3∶2，体积比），2 000 r/min离心10 min。取上清液测定其吸光度（OD540nm），对照标准曲线求羊骨水溶液中多肽浓度（mg/mL），从而求得羊骨多肽含量（g/100 g）。

1.3.5 游离氨基酸组成及含量测定

参照吴琴燕等[19]的方法并作修改。称取骨粉60 mg经液氮研磨后，分别加入0.5 mL甲醇-乙腈水溶液（2∶2∶1，体积比），涡旋 1 min后低温超声 60 min，-20℃条件下静置1 h沉淀蛋白，取上清液进行冷冻干燥。采用超高效液相色谱系统进行分离，采用多反应检测扫描（multi reaction monitoring,MRM）模式来检测待测离子对。提取色谱峰面积和保留时间并用标准品校正保留时间，进行定性定量分析。

1.3.6 氨基酸评分和化学评分分析

根据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO）和世界卫生组织（World Health Organization,WHO）建议的氨基酸标准评分模式（FAO/WHO模式），以及中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所提出的全鸡蛋蛋白质评分模式（Egg模式），分别按照公式（1）～（3）计算氨基酸评分（amino acid score,AAS）、化学评分（chemical score,CS）和必需氨基酸指数（essential amino acid index,EAAI）[20]。根据所测样品中蛋白质含量，将样品中必需氨基酸含量（mg/g骨粉）换算为蛋白质中必需氨基酸含量（mg/g蛋白质）。

式中：Ax为骨粉蛋白质中必需氨基酸含量，mg/g；Ao为FAO/WHO评分标准模式中同种必需氨基酸含量，mg/g。

式中：Cx为骨粉蛋白质中必需氨基酸含量，mg/g；Co为Egg评分标准模式中同种必需氨基酸含量，mg/g。

式中：n为必需氨基酸数；t为骨粉蛋白质中必需氨基酸含量，mg/g；s为标准模式中同种必需氨基酸含量，mg/g。

1.3.7 脂肪酸组成及含量测定

参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》[21]中的内标法测定脂肪酸。使用氯仿-甲醇溶液提取样品，然后用硫酸-甲醇溶液甲酯化，水杨酸甲酯作内标，混合均匀后加入进样瓶，进行气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spec-trometry,GC-MS）检测。根据色谱峰面积及保留时间，绘制标准曲线，进行定性定量分析。

气相色谱条件：DB-WAX毛细管柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；升温程序：初始温度 50 ℃，保持 3 min；以10℃/min速度升高至220℃，维持5 min；载气氦气，流速1.0 mL/min。

质谱条件：进样口温度280℃；离子源温度230℃；传输线温度250℃；电子轰击电离源（electron impact ionization,EI）；单离子检测扫描（single ion monitoring,SIM）模式；电子能量70 eV。

1.4 数据处理

所有试验平行测定3次，数据以平均值±标准差表示。试验数据采用Excel 2016软件和SPSS 22.0软件进行方差分析和显著性分析。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 黑藏羊骨与湖羊骨硬度对比分析

黑藏羊骨与湖羊骨硬度见图1。

图1 骨硬度Fig.1 Bone hardness

由图1可知，黑藏羊骨与湖羊骨硬度分别为16 643.00 g和15 988.00 g，黑藏羊骨与湖羊骨硬度差异不显著（P＞0.05）。

2.2 黑藏羊骨与湖羊骨基本营养成分含量对比分析

黑藏羊骨与湖羊骨基本营养成分含量见表1。

表1 骨基本营养成分含量Table 1 Bone basic nutrient content g/100 g

由表1可知，黑藏羊骨与湖羊骨水分含量分别为14.32、9.40g/100g；灰分含量分别为40.29、50.20 g/100 g；粗蛋白含量分别为27.74、16.21 g/100 g；粗脂肪含量分别为8.43、4.63 g/100 g。黑藏羊骨灰分含量极显著低于湖羊骨（P＜0.01），水分、粗蛋白、粗脂肪含量极显著高于湖羊骨（P＜0.01）。蛋白质和脂肪含量是评价食品营养价值的重要参考因素[22]。李享等[7]研究表明牦牛骨粗蛋白含量为19.88%～20.37%，粗脂肪含量为15.55%～22.46%，说明黑藏羊骨与牦牛骨相比具有高蛋白、低脂肪特点。吴婷等[8]的研究发现不同部位畜骨营养成分差异显著，说明不同畜种和畜骨部位都可能是黑藏羊骨与牦牛骨营养成分差异显著的原因。此外，由于黑藏羊常年生活在高海拔地区，缺氧的环境造就了黑藏羊骨强大的造血功能来维持血液中血红蛋白对氧气的运输，而骨髓中的脂肪细胞对造血微环境有抑制作用，这可能是黑藏羊骨与牦牛骨相比具有高蛋白低脂肪特征的原因之一[23-25]。Zhang等[26]的研究表明藏羊肉中蛋白质含量为26.45 g/100 g，脂肪含量为4.70 g/100 g，说明藏羊骨的营养价值可以与藏羊肉媲美。虽然黑藏羊骨脂肪含量与湖羊骨及藏羊肉相比较高，但低于其他畜骨和畜肉脂肪含量，满足低脂肪食品的要求[27]，且较高的脂肪含量可以提高食品风味[28]，因此黑藏羊骨不仅营养价值高于湖羊骨，其风味也优于湖羊骨，说明黑藏羊骨更加符合人们对高品质食品的追求，黑藏羊骨极具开发潜力。

2.3 黑藏羊骨与湖羊骨多肽含量对比分析

黑藏羊骨与湖羊骨多肽含量见图2。

图2 骨多肽含量Fig.2 Bone peptide content

由图2可知，黑藏羊骨与湖羊骨多肽含量分别为6.87 g/100 g和4.00 g/100 g，黑藏羊骨多肽含量显著高于湖羊骨（P＜0.05）。羊骨蛋白质主要组成物质为胶原蛋白，多肽作为胶原蛋白主要水解产物[29]，具有抗氧化、抑制微生物、抗骨质疏松、提高免疫力、抗高血压等生物学功能[30]。研究结果表明黑藏羊骨具有更好的营养价值和生物学功能，可作为提取骨多肽的良好生物来源。

2.4 黑藏羊骨与湖羊骨游离氨基酸组成及含量对比分析

黑藏羊骨与湖羊骨游离氨基酸组成及含量见表2。

氨基酸的类型和含量决定了蛋白质的营养价值[31]。由表2可知，羊骨中共检出19种氨基酸，其中包括8种必需氨基酸，2种半必需氨基酸，8种非必需氨基酸，以及1种亚氨基酸（羟脯氨酸）。黑藏羊骨和湖羊骨TAAs含量分别为 45.94、21.89 mg/g，EAAs含量分别为13.24、5.88 mg/g，鲜味氨基酸（delicious amino acids，DAAs）含量分别为 14.27、5.76 mg/g。黑藏羊骨 TAAs、EAAs、DAAs含量均极显著高于湖羊骨（P＜0.01）。在黑藏羊骨的必需氨基酸中，赖氨酸含量最高（3.15 mg/g），其次为缬氨酸（2.89 mg/g）和亮氨酸（2.23 mg/g），均极显著高于湖羊骨（P＜0.01）。亮氨酸和缬氨酸是组成支链氨基酸的重要部分，它们具有调控机体糖和脂质代谢、蛋白质合成以及增强免疫等多种生物学功能[32]。在黑藏羊骨鲜味氨基酸中，丙氨酸含量最高（6.94 mg/g），其次为谷氨酸（3.89 mg/g）和甘氨酸（3.44 mg/g），均极显著高于湖羊骨（P＜0.01）。谷氨酸对鲜味有贡献，甘氨酸和丙氨酸则表现出甜味[33]，它们能赋予食品更好的风味。甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸作为胶原蛋白特征性氨基酸可与羟脯氨酸一起表征畜骨中的胶原蛋白含量[34]，其中黑藏羊骨脯氨酸（2.91 mg/g）含量极显著高于湖羊骨（P＜0.01），羟脯氨酸（0.28 mg/g）含量也显著高于湖羊骨（P＜0.05），表明黑藏羊骨胶原蛋白含量显著高于湖羊骨，与多肽含量的结果一致，对于开发高附加值产品具有广泛前景。

2.5 黑藏羊骨与湖羊骨氨基酸评分及化学评分对比分析

黑藏羊骨与湖羊骨氨基酸评分和必需氨基酸指数见表3。

表3 骨氨基酸评分和必需氨基酸指数Table 3 Amino acid scores and essential amino acid indexes of bone

由表3可知，黑藏羊骨的第一限制氨基酸为苏氨酸（0.06），湖羊骨的第一限制氨基酸为色氨酸（0.04），说明在羊骨中苏氨酸和色氨酸提供的营养价值较低，而在牛骨中甲硫氨酸+半胱氨酸为第一限制氨基酸[7]，表明不同畜骨的氨基酸功能存在差异。黑藏羊骨中赖氨酸评分最高，为0.28，缬氨酸和亮氨酸也有较好的氨基酸评分，分别为0.26、0.20，这与牛骨中的结果一致[7]。其中黑藏羊骨赖氨酸和缬氨酸评分极显著高于湖羊骨（P＜0.01）。湖羊骨中亮氨酸评分最高，为0.20，与黑藏羊骨相同。以FAO/WHO模式作为评价标准，黑藏羊骨和湖羊骨EAAI分别为1.02和0.99。综上，黑藏羊骨AAS高于湖羊骨，表明黑藏羊骨蛋白质质量优于湖羊骨。两种羊骨CS和必需氨基酸指数结果见表4。

表4 骨化学评分和必需氨基酸指数Table 4 Chemical scores and essential amino acid indexes of bone

由表4可知，以Egg模式作为评价标准，黑藏羊骨和湖羊骨EAAI分别为0.98和0.95。化学评分结果与氨基酸评分结果保持一致，再次表明黑藏羊骨蛋白质质量优于湖羊骨，更接近全鸡蛋蛋白质。EAAI是衡量样品蛋白质营养价值的主要指标，EAAI越接近1，样品蛋白质必需氨基酸组成越接近标准蛋白质，营养价值越高[35]。黑藏羊骨EAAI为0.98～1.02，湖羊骨EAAI为0.95～0.99，黑藏羊骨比湖羊骨更接近标准值，并且高于猪骨（0.66）[36]，表明黑藏羊骨是一种优质蛋白质资源。

2.6 黑藏羊骨与湖羊骨脂肪酸组成及含量对比分析

黑藏羊骨与湖羊骨脂肪酸组成及含量见表5。

表5 骨脂肪酸组成及含量Table 5 Fatty acid composition and content of bone

续表5 骨脂肪酸组成及含量Continue table 5 Fatty acid composition and content of bone

由表5可知，在黑藏羊骨与湖羊骨中共检出29种脂肪酸，其中包括饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）12种，单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）6种，多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFAs）11种。黑藏羊骨与湖羊骨总脂肪酸（total fatty acids，TFAs）含量分别为 5 736.85、2 785.94 mg/100 g。黑藏羊骨 TFAs、SFAs、MUFAs、PUFAs含量均极显著高于湖羊骨（P＜0.01）。黑藏羊骨和湖羊骨中n-6/n-3 比值分别为 6.41、3.29，C16：0/C18：1 比值分别为0.49和0.36，其中黑藏羊骨n-6/n-3比值显著高于湖羊骨（P＜0.05），两种羊骨的 C16：0/C18：1 比值差异不显著。油酸、棕榈酸、棕榈油酸是羊骨的特征脂肪酸，这与吴婷等[8]的研究结果一致。不饱和脂肪酸具有多种生理调节功能，包括清理血栓、调节血脂、提高视力等[37]。在黑藏羊骨单不饱和脂肪酸中，油酸含量最高（2 639.61 mg/100 g），棕榈油酸次之（85.76 mg/100 g）。油酸可以在一定程度上降低高血脂患者血脂水平同时预防心血管疾病，此外油酸还是肉制品中主要的风味脂肪酸[38]。棕榈油酸能影响脂肪的形成，对肥胖症起到一定的治疗效果，还可以影响多种血糖代谢关键酶、调节患者的胰岛素分泌[39]。而多不饱和脂肪酸能够降低血清中胆固醇含量[40]，在多不饱和脂肪酸中，n-6/n-3比值是评价食品营养价值以及是否可以作为健康食品提供给消费者的重要指标[41]。建议在人类饮食中，n-6/n-3的比值介于4～6之间，以帮助维持良好的心血管健康[42]。此外，研究还发现降低人类饮食中C16：0/C18：1有利于提高胰岛素敏感性[43]，从而降低患糖尿病的风险。综上所述，黑藏羊骨脂肪酸在含量和组成上均优于湖羊骨，具有较好的营养价值和生理功能，相关功能性产品的开发潜力大。

3 结论

本文研究了青海黑藏羊骨硬度、水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白、多肽含量、游离氨基酸组成、氨基酸评分和脂肪酸组成，并与湖羊骨进行了对比分析。黑藏羊骨水分、粗脂肪、粗蛋白含量均极显著高于湖羊骨（P＜0.01），多肽含量也显著高于湖羊骨（P＜0.05），而灰分含量极显著低于湖羊骨（P＜0.01）。黑藏羊骨总氨基酸、必需氨基酸、鲜味氨基酸含量均极显著高于湖羊骨（P＜0.01）。黑藏羊骨第一限制氨基酸为苏氨酸，湖羊骨第一限制氨基酸为色氨酸，黑藏羊骨具有较高的氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数，氨基酸组成更接近FAO/WHO模式和全鸡蛋模式。黑藏羊骨总脂肪酸、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量均极显著高于湖羊骨（P＜0.01），n-6/n-3比值也显著高于湖羊骨（P＜0.05），更接近有利于人体健康的标准值。本文研究结果显示，黑藏羊骨的营养品质较好，且优于湖羊骨，研究结果为黑藏羊骨进一步加工利用提供了依据。