杨海朋，王自强，王云山*，张利平，苏志国

（1.河北大学生命科学学院，河北保定071002；2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190）

丙酸发酵过程中四种有机酸快速、简便的分析方法

杨海朋1，2，王自强2，王云山2*，张利平1，苏志国2

（1.河北大学生命科学学院，河北保定071002；2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190）

产酸丙酸杆菌在发酵生产丙酸的同时也会伴随有机杂酸的产生，通过对4种有机酸的监测以期调控发酵条件，从而使丙酸高产。应用HPLC的方法分别研究了在不同流动相种类、pH、洗脱条件、流速、柱温条件下四种有机酸的分离状况，建立了快速、简便测定丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸四种有机酸的方法。结果表明，色谱柱条件为COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6 mm×250 mm），检测器为紫外检测器，紫外检测波长为210 nm，流动相为K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L）和乙腈（0～1%梯度洗脱），流速1.0 m L/min，柱温25℃，进样量10 μL，采用外标法定量。在该条件下各物质线性回归方程相关系数均＞0.999，加样回收率均在95%～105%，精密度实验结果相对标准偏差均＜5.0%，表明该方法准确度高、精密度好，可为丙酸发酵过程中四种有机酸的监控及发酵调控提供数据参考。

高效液相色谱；丙酸；发酵；有机酸；检测

丙酸又称甲基乙酸，是一种常见的天然有机弱酸，无色透明带刺激气味的液体，有吸湿性，具有爆炸危险［1］。对人畜基本无害，被广泛应用于谷物、饲料和食品的防腐保鲜中［2-3］。同时也可用于制取有机化工原料及中间体α-氯丙酸、2，2-二氯丙酸和α-嗅丙酸等［4］。在医药领域，丙酸可作医药中间体［5］。其生产方法主要有两种：一是化学合成法，主要以石油为原料经过丙醛氧化或乙烯羟基化生产［6］；二是微生物发酵法，用丙酸杆菌代谢得到丙酸。

在目前广泛使用的三大防腐剂中，丙酸是公认的最经济实惠且安全有效的食用性防腐剂，微生物发酵法生产丙酸作为绿色安全的生产方法得到了广泛的关注，但产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）在发酵生产丙酸时，同时会产生一定乙酸、乳酸、丁二酸等有机杂酸，不仅降低了糖酸转化率，同时为后期的分离提纯产生了很大的影响。发酵过程中对这4种有机酸含量的监测以期调控发酵条件，实现丙酸产量的提高是需要解决的首要问题。

目前丙酸的检测中一般采用水蒸气蒸馏提取法，反向液相色谱［7］和气相色谱法［8-9］，而乳酸、乙酸和丁二酸有报道通过中和滴定法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［10］、生物传感器法、直接进样色谱法、酯化处理间接进样色谱法、比色法和综合测定等方法进行测定［11］，其中HPLC法具有样品预处理简单、灵敏度高和分析时间短等优点［12］。本研究通过应用HPLC的方法对4种有机酸的分离条件进行研究，使4种有机酸通过HPLC方法很好的分离，方便发酵过程中4种有机酸的监控，为丙酸的发酵调控提供一定的数据参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）WY 320菌株：本实验室筛选保藏。

酵母浸膏：安琪酵母股份有限公司；玉米浆干粉：河北灵山鹤植物蛋白制造有限公司；葡萄糖、氨水、硫酸铵、丙酸钠、丁二酸钠、乙酸钠、乳酸钙（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：Fisher公司；磷酸氢二钾（色谱纯）：西陇化工股份有限公司。

种子培养基：葡萄糖35 g/L，玉米浆20 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，pH控制7.0；

发酵培养基：葡萄糖60 g/L，玉米浆30 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，pH控制在7.0。

1.2仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪（配置LCsolution色谱工作站，LC-20AT恒流泵，SIL-20A进样器，SPD-20A紫外检测器）：日本岛津公司；COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱（4.6 mm× 250 mm）：北京吉瑞森科技有限责任公司；7L全自动搅拌式发酵罐：上海百仑生物科技有限公司，PL 203电子天平、Delta 320 pH计：瑞士梅特勒托利多公司；SHB-111循环水式多用真空泵：上海振捷实验设备有限公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

分别精确称取4种有机酸1 g，用超纯水分别定容至100 m L，配制成质量浓度为10 g/L的母液，备用。

1.3.2样品制备

将活化后由甘油管保存的2 m L产酸丙酸杆菌菌液接种到50 m L种子培养基，30℃培养48 h；后转接至500 m L种子培养基，30℃培养48 h；按10%的接种量接种到7 L发酵罐中，30℃、50 r/min发酵50 h，10 000 r/min离心5 min，取上清放入4℃冰箱冷藏，备用。

1.3.3检测波长的确定

本实验采用色谱柱COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6 mm× 250 mm），紫外检测器，在检测温度40℃，进样量10 μL等条件下研究样品的最佳分离条件。

因丙酸、乙酸、乳酸和丁二酸在波长210 nm处均有较为明显的吸收［13-14］，故检测波长选择210 nm。

1.3.4流动相种类的确定

通过查阅柱子及待分离物质的性质来确定流动相种类。

1.3.5色谱条件的确定

分别在pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0时，流动相的乙腈浓度在0～1%、1%～2%、0～2%，柱温分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，流速分别在0.4m L/min、0.6m L/min、 0.8m L/min、1.0m L/min、1.2m L/min、1.4m L/min、1.6 m L/min时进行4种有机酸分离情况的研究。

1.3.6标准曲线的绘制

分别配制标准溶液质量浓度为1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L，按照已确定的最优条件方法，应用HPLC的同时联用紫外检测器，使4种经过C18柱子分离的物质分别经过紫外检测器进行标准曲线的绘制。

1.3.7重复性实验

取发酵50 h离心后的上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，0.22 μm滤膜过滤，分别配制6次相同上清液进行测定，采用优化后的HPLC条件进行重复性实验。

1.3.8精密度实验

取发酵50 h离心后的上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，0.22 μm滤膜过滤，采用优化后的HPLC条件，对一个样品重复进样6次进行精密度实验。

1.3.9加样回收率实验

取已知含量的样品，准确加入定量的标准品。重复进样6次，采用已优化好的HPLC条件测定各物质总含量，并计算其加样回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

2　结果与分析

2.1流动相种类的确定

通过查阅柱子及分离物质的性质，确定流动相为K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L）和乙腈［15］。一方面COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱采用高纯度耐酸碱的硅胶为填料，在全水情况下分离情况良好；另一方面发酵液中4种有机酸性质较为相近，均为亲水性较强的有机酸且许多缓冲溶液在波长210 nm附近有较强的吸收，使得本底值提高，灵敏度降低，有时根本无法测定。磷酸盐缓冲溶液是最典型、适用的洗脱液，在紫外区几乎无吸收，可作为有机酸测定的流动相，故选择K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L）作为流动相，乙腈为有机溶剂帮助洗脱；再有考虑到流动相pH对酸的电离和柱子寿命的影响，采用稀H3PO4作为流动相pH的调节酸。

2.2流动相pH的确定

在pH3.0，4%乙腈，流速1.0 m L/min，室温（25℃）条件下考察流动相不同pH值时4种有机酸的分离情况。丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸的酸度系数（pKa）分别为4.874、3.860、4.757、4.218，因C18柱子分离原理是分子的疏水性，而4种酸在pH≤4.0时以分子状态存在，另一方面pH过低会影响柱子使用寿命，故分别取pH在2.0，2.5，3.0，3.5，4.0（用4%稀H3PO4进行pH的调节）时进行研究，结果见图1。

由图1可知，pH在2.0、2.5、3.0、3.5时乳酸和乙酸分离效果不好，丁二酸和丙酸出峰时间过晚，pH在4.0时4种酸分离效果较好且出峰时间相对较早，保留时间相差较大，故选择最优pH值为4.0。

图1　不同pH条件下4种有机酸的分离情况Fig.1 Separation conditions for four organ ic acids in differen t pH

2.3乙腈洗脱浓度的确定

在pH4.0，流速1.0 m L/min，室温（25℃）条件下考察不同乙腈洗脱浓度时4种有机酸的分离情况。选择流动相的乙腈洗脱浓度在0～1%，1%～2%，0～2%进行乙腈梯度洗脱的研究，结果见图2。

图2　不同乙腈浓度下4种有机酸的分离情况Fig.2 Separa tion conditions for four organic acids in different concentrations of acetonitrile

由图2可知，乙腈浓度在0～1%梯度洗脱时，效果最好，故最优乙腈洗脱浓度为0～1%梯度洗脱。

2.4柱温的确定

图3　不同柱温条件下4种有机酸的分离情况Fig.3 Separation conditions for four organic acids in different colum n tem perature

在pH 4.0，乙腈（0～1%梯度洗脱），流速1.0 m L/min条件下考察不同柱温时4种有机酸的分离情况。选择温度分别在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃时进行四种有机酸分离情况的研究，结果见图3。

由图3可知，柱温对于4种物质的分离情况影响不大，分离差异不明显，在25℃时分离效果较好，故最优柱温为25℃。2.5流速的确定

在pH4.0，乙腈（0～1%梯度洗脱），室温（25℃）条件下考察不同流速时4种有机酸的分离情况。分别选取流速为0.4m L/min、0.6m L/min、0.8m L/min、1.0m L/min、1.2m L/min、1.4 m L/min、1.6 m L/min进行4种酸分离情况的研究，结果见图4。

图4　不同流速条件下4种有机酸的分离情况Fig.4 Separation conditions for four organic acids in different flow rates

由图4可知，随着流速的不断增加，洗脱时间逐渐变短，分离效果逐渐变差。且可以看出在0.4 m L/m in时分离效果最佳，但此条件下整个检测方法耗时过长，考虑到检测方法耗时和分离情况的综合因素，最优流速选为1.0 m L/min。

2.6标准曲线

按照最优色谱条件即流动相为K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L），pH4.0，乙腈（0～1%梯度洗脱），流速1.0 m L/m in，室温（25℃）时进行标准曲线的测定，应用HPLC的同时联用紫外检测器，使4种经过C18柱子分离的物质分别经过紫外检测器进行测定，其高效液相色谱图见图5，4种物质的线性回归方程及相关指标见表1。

图5　四种有机酸标准品分离情况Fig.5 Separation conditions of standard substance of four organic acids

表1　四种有机酸的线性回归方程、保留时间及线性范围Table 1 Linear regression equa tion，retention time and linear range of four organic acids

由图5和表1可知，各种物质有很好的分离效果，以组分浓度X对峰面积Y进行线性拟合，方程的相关系数均＞0.999。

2.7重复性实验

取发酵50 h离心后的发酵上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，用0.22 μm的滤膜过滤，分别配制6次相同上清液进行测定，采用优化后的HPLC条件进行准确度实验，分离情况见图6。

图6　发酵液中四种物质分离情况Fig．6 Separation conditions o f four organic acids in fermentation broth

分别计算4种物质的相对标准偏差（RSD），结果为丙酸2.87%，乙酸2.73%，乳酸2.03%，丁二酸2.42%，4种物质的RSD均＜5%，可见此分析方法重复性良好，可满足分析要求。

2.8精密度实验

取发酵50 h离心后的发酵上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，用0.22 μm的滤膜过滤，采用优化后的HPLC条件进行精密度实验，对一个样品重复进样6次，计算4种物质检测结果的相对标准偏差分别为丙酸2.47%，乙酸1.68%，乳酸2.38%，丁二酸1.58%，4种物质检测结果的相对标准偏差（RSD）均＜5%，可见该方法的精确性良好，可满足分析要求。

2.9加样回收率实验

取已知含量的样品，准确加入定量的标准品。重复进样6次，采用已经优化好的HPLC条件测定各物质总含量，并计算其加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。由表2可知，各物质的RSD在2.26%～5.06%，加样回收率为95%～105%，回收率较好，表明该方法准确可靠，满足分析要求。

表2　四种酸加样回收率实验结果Table 2 Results of adding standard recovery rate experiment of four organic acids

3　结论

通过优化流动相组成及配比、pH值、流速和柱温等条件，建立了一种基于HPLC的快速测定产酸丙酸杆菌发酵液中丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸的方法，具有分析速度快、线性范围宽、灵敏度高等优点，可用于丙酸杆菌发酵生产丙酸实时监控。色谱条件为COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱（4.6 mm×250 mm），紫外检测器，紫外检测波长为210 nm，流动相为K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L）和乙腈（0～1%梯度洗脱），流速1.0 m L/min，柱温25℃，检测器温度40℃，进样量10 μL，采用外标法定量。

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Fast and convenient determ ination method of four organic acids during propionic acid fermentation

YANG Haipeng1，2，WANG Ziqiang2，WANG Yunshan2*，ZHANG Liping1，SU Zhiguo2
（1.College of Life Science，Hebei University，Baoding 071002，China；2.National Key Laboratory of Biochem ical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China）

Propionibacterium not only produces propionic acid during fermentation，but also produces organic acids.In order to obtain propionic acid w ith high production，four organic acids were monitored to regulate fermentation conditions.The separation conditions of propionic acid，lactic acid，acetic acid and succinic acid under different mobile phases，pH，elution conditions，flow rates，column tem peratures were explored by HPLC.Then a fast and convenient method was set up to determ ine the contents of four organic acids.Results showed that the optimal conditions were column COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6 mm×250 mm），ultraviolet detector with wavelenth of 210 nm，0.02 mol/L KH2PO4and 0-1%acetonitrile as mobile phase，flow rate 1.0 m l/m in，column temperature 25℃and loading volume 10 μl，and the acids contents were quantified w ith external standard method. Under these conditions，the correlation coefficients R2were all more than 0.999，the average adding recoveries were 95%-105%，RSD of precision tests results were all less than 5.0%.The method was with high accuracy and good precision，and it was suitable for four organic acids contents determ ination in propianic acid fermentation，which provided reference for monitoring and controlling four orangic acids in fermentation.

HPLC；propionic acid；fermentation；organic acid；determ ination

Q815

0254-5071（2016）05-0107-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．022

2016-03-09

国家重点基础研究发展计划'973'基金资助项目（2013CB733604）；国家自然科学基金资助项目（21506227）

杨海朋（1991-），男，硕士研究生，研究方向为生物工程。

王云山（1962-），男，研究员，博士，研究方向为微生物发酵。