赵锡武　刘　鑫　荣　辉　于兴胜　刘　通　杨长生　赵廷宝

济南军区总医院脊髓修复科　济南　250031

神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤效果与机制对比

赵锡武刘鑫荣辉于兴胜刘通杨长生赵廷宝△

济南军区总医院脊髓修复科济南250031

【摘要】目的比较神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的机制及实验效果。方法选择40只Wistar成年大鼠做脊髓半横切模型，随机分为神经干细胞注射组，骨髓间充质干细胞注射组，磷酸盐缓冲液注射组和假手术组，每组10只。对比4组大鼠移植后的运动功能和脊髓损伤的修复情况。结果神经干细胞注射组各个时间点的BBB评分明显高于骨髓间充质干细胞注射组，且2组BBB评分明显高于磷酸盐缓冲液注射组，差异具有统计学意义(P<0.05)；神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植后的第8周，MRI显示空洞明显缩小，信号强度正常，能看到完整的脊髓，脊髓切片中能看到被标记的NSCs及BMSCs。结论脊髓损伤大鼠通过静脉注射NSCs和BMSCs均能改善运动功能，但NSCs治疗效果更为明显，应将两种方法结合起来，进一步提高治疗效果。

【关键词】神经干细胞；骨髓间充质干细胞；脊髓损伤；大鼠；BBB评分

脊髓损伤为中枢神经系统的严重创伤，很难自我修复，干细胞移植是最为有效的治疗方法[1]。相关实验证明，神经干细胞(NSCs)可以促进损伤脊髓的修复，但涉及到伦理学、来源等问题，应用数量受到限制[2]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脊髓损伤有一定治疗作用，而且BMSCs可以从患者自身体内获得，不涉及伦理学方面的问题。本组研究对选择的40例成年Wistar大鼠建立脊髓半横切模型，分别采用神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植进行治疗，现将具体实验过程和结果介绍如下。

1实验材料和方法

1.1BMSCs的取材和培养实验材料：WISTAR大鼠、75%酒精、Hanks液、MEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、冻存液、超净工作台、LSI90型台式离心机、电子精密天平、CO2恒温培养箱、过滤网、倒差显微镜、培养瓶、手术中所用的器械和无菌医用工具等。

取材、分离及培养：(1)处死WISTAR大鼠，全身浸入75%酒精中进行皮肤消毒，浸泡5 min后取出，置于无菌培养皿中转移到超净工作台。(2)更换无菌手套，器械行消毒灭菌处理。(3)剪开皮肤，分离筋膜并离断股骨和胫骨，将表面肌肉和筋膜游离出来，浸入Hanks液中，再取出对侧胫骨与股骨。(4)更换无菌手套后用无菌镊从Hanks液中取出双侧股骨及胫骨，放到无菌纱布上，将Hanks液擦干。(5)将骨髓腔暴露出来，吸取BMSCs培养基反复冲洗骨髓腔和4根长骨，收集冲洗液过滤后将过滤液进行收集。(6)过滤液离心去上清，加入5 mL培养基混匀沉淀。(7)将细胞悬液进行稀释后接种到75 mL培养瓶中，防到37 ℃、5%的CO2恒温培养箱中培养。(8)进行原代第2代及后代培养，每隔72 h进行换液，收集、冻存或继续接种培养好的细胞。

根据国际细胞治疗学会的标准进行鉴定：可以贴壁生长；有特异的表面抗原表达；具有多向分化潜能。光镜下能看见培养细胞的形态及生长；第3代和第9代细胞可以检测出有特异细胞表面标记表达；诱导剂成功后，用油红及ALP钙-钻法分别进行染色，鉴定细胞种类。

1.2NSCs的分离培养实验材料：手术器械、培养皿、超净工作台、过滤网、恒温摇床和离心机等和骨髓间充质干细胞的分离培养材料一样，另外有WISTAR雌、雄大鼠、苦味酸、酒精、蒸馏水、0.01 M PBS液(磷酸盐缓冲液)、解剖显微镜、微镊、DMEM/F12培养基等。

孕鼠繁殖：在小鼠四肢、背部等部位进行标记，配置苦味酸液，将成年大鼠以雄雌1∶2的比例合笼，第2天检查阴栓，如果在雌鼠阴道口看到乳白色的同体即为“阴栓”。取材、分离和培养：取孕12～13 d的WISTAR大鼠并处死，放入超净工作台之前的步骤和BMSCs一致；将孕鼠腹膜、腹腔、盆腔等脏器分别暴露出来；将孕鼠子宫放入平皿中，浸入预冷0.01 M PBS中；将胎鼠取出，放入另外一个平皿中，浸入预冷0.01 M PBS中；将胎脑分离，用PBS冲洗后剥除脑膜，将全脑组织剪碎后放入试管中，用0.125%的胰酶和DNA酶放到37 ℃的恒温摇床消化5 min；制成单细胞悬液离心10 min，弃除上清液，进行重悬后过滤，调整细胞密度后接种到培养瓶中进行培养；当发现细胞形成悬浮神经球时表明培养成功；进行接种传代，5～7 d传代1次，然后收集、冻存或继续接种培养。

鉴定：光镜观察细胞生长情况，检测Nestin表达，放入10% FBS和多聚赖氨酸包被的玻片培养5 d，光镜观察玻片，检测APC、MAP2的表达。

1.3Brdu标记BMSCs及NSCs第3代BMSCs和BMSCs进入对数生长期时，加入BrdU(终浓度10 mmol/L)，移植前将细胞制成PBS悬液，检测BrdU阳性细胞率。

1.4实验动物造模及干细胞移植动物分组：选择Wistar成年雄性大鼠40只，体质量230～250 g，随机分为NSCs注射组，BMSCs注射组，PBS注射组和假手术组，每组10只，其中假手术组不做任何处理，其他3组造模后脊髓分别移植NSCs、BMSC和注射PBS，均为尾静脉注射。

大鼠脊髓损伤模型的制作和干细胞移植：将大鼠T9-11节段做好标记，更换无菌手套，进行消毒铺巾；完全暴露T9-11节段并向头尾各延长一节段，将T10棘突和椎板咬去，暴露脊髓；用虹膜刀片横断右侧脊髓，充分止血后依次缝合各层组织，消毒后包扎伤口，术中密切观察大鼠生命体征；术后补液、给予抗生素，每天为大鼠按摩膀胱，帮助大鼠恢复排尿功能。制备细胞悬液，术后第7～9天，对尾静脉注射1 mL细胞悬液。

1.5术后评估运动功能评价：采用BBB运动功能评分，每周进行1次，共观察8周。BBB满分为21分，得分越低表示运动功能越差。影像学检查：所有大鼠每周进行1次磁扫描观察脊髓损伤的修复情况。组织学鉴定和免疫荧光染色：术后8周在光镜下观察组织切片，标本行冰冻切片，并行抗Br-dU、DAPI免疫荧光染色，观察移植细胞的迁入情况。

2结果

2.14组大鼠术后各个时间点BBB评分的变化NSCs注射组、BMSCs注射组和PBS注射组大鼠的下肢功能均有不同程度的恢复。NSCs注射组的下肢功能恢复最好，各个时间点的BBB评分均明显高于BMSCs注射组和PBS注射组，而BMSCs注射组又明显高于PBS注射组，差异具有统计学意义(P<0.05)；3组大鼠BBB评分随时间的推移，均有不同程度提高。见表1。

表1　4组大鼠术后各个时间点BBB评分变化±s，分)

注：和PBS组比较，aP<0.05；和BMSC组比较，bP<0.05

2.2机械通气后的相关指标变化本组40只大鼠均造模成功，术后无死亡情况。MRI观察脊髓损伤后第7天横断处有缺损和空洞明显，信号较低。NSCs和BMSC移植后的第8周，MRI显示空洞明显缩小，信号强度正常，能看到完整的脊髓。脊髓损伤后第1周HE染色切片显示受损节段的脊髓组织有较多空隙，第8周HE染色切片显示，受损脊髓组织的空洞被炎性细胞、肉芽组织填充，可能有干细胞迁移到此处。

3讨论

目前脊髓损伤最为有效的治疗方法是干细胞移植，神经干细胞治疗效果较好，但数量有限，而且存在伦理学的问题，因此要寻找新的干细胞来源才能从根本上解决这些问题。近年来，骨髓间充质干细胞对脊髓损伤的开始受到相关专家的重视，骨髓间充质干细胞能从自身的骨髓组织中提取到，还可从他人的捐赠中得到，来源比较广泛，而且没有伦理学方面的问题[3-4]。相关实验研究已经证实，骨髓组织具有较强的再生能力，而且骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，能向神经组织分化，促进脊髓损伤的修复，骨髓间充质干细胞还能保持干细胞特异性的分子标记，还具有自我更新的能力[5]。

本研究结果显示，NSCs注射组和BMSCs注射组大鼠术后各个时间点的BBB评分明显高于PBS注射组，而且NSCs注射组术后各个时间点的BBB评分最高，3组大鼠BBB评分随时间的推移，均有不同程度的提高，研究结果提示，骨髓间充干细胞和神经干细胞均可以明显的改善脊髓损伤大鼠的运动功能，神经干细胞组的恢复较骨髓间充干细胞组要好。本研究还发现，虽然假手术组未经任何治疗，但运动功能的一部分可以自行恢复，只是恢复程度较低[6]。但在人体当中，一旦脊髓受到损伤，患者运动和感觉功能会严重受损，且恢复非常缓慢，这和大鼠相比具有明显的差别，因此提示进行相关研究时，要注意动物和人的差别，不能轻易将动物实验结果推广到人[7]。

BMSCs对脊髓损伤的修复机制目前普遍认为是由于以下几个方面：BMSCs移植后分化为神经元使髓鞘重新产生，分泌神经营养因子[8]。研究[9]显示，将BMSCs注射到长期瘫痪的大鼠，2个月后观察到损伤的脊髓空洞被BMSCs标记的组织块填充，而且表达神经元和神经胶质细胞的标记蛋白。另有研究[10]显示，BMSCs移植到脊髓脱髓鞘的大鼠后，在体内能形成有功能的髓鞘细胞。

本组40只大鼠均造模成功，并全部成活，MRI显示脊髓损伤后第7天横断处有缺损和空洞明显，低信号。干细胞移植后的第8周，空洞明显缩小，信号正常，并能看到完整的脊髓。脊髓损伤后第8周HE染色切片显示，受损脊髓组织的空洞被炎性细胞、肉芽组织填充，此处可能有干细胞迁移。虽然BMSCs移植修复大鼠脊髓损伤的效果没有NSCs移植的效果好，但可通过改进BMSCs的移植方案或采取综合移植方案提高治疗效果。

本研究认为，骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤不能只限于单一的细胞移植，而应该从组织工程学的角度出发，考虑综合移植的方案。在开展研究前应要建立标准的治疗规范，使研究的结果更为准确和有意义。

4参考文献

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(收稿2015-08-11)

Comparative of the effects and mechanisms of neural stem cells and bone marrow-derived stem cells transplantations in the treatment of spinal cord injury

ZhaoXiwu，LiuXin，RongHui，YuXingsheng，LiuTong，YangChangsheng，ZhaoTingbao

DepartmentofSpinalCordRestoration，GeneralHospitalofJinanMilitaryArea，Jinan250031，China

【Abstract】Objective To compare the effects and mechanisms of neural stem cells (NSCs) and bone marrow-derived stem cells (BMSCs) transplantations in the treatment of spinal cord injury. Methods Forty adult Wistar rats with the hemi-transection of spinal cord were randomly divided into group A (injected with NSCs)， group B (injected with BMSCs)， group C (injected with phosphate buffer) and group D (sham-operation group)， 10 rats per group. The motor function and the restoration of the injured nerves of the four groups after transplantation were comparatively observed. Results BBB scores of group A at each time point were significantly higher than that of group B， furthermore， both the group A and group B hold higher BBB scores than group C (P<0.05)； In the 8thweek after transplantation of neural stem cells or MSCs， MRI indicated that the hole was significantly reduced with normal signal strength， complete spinal cord were seen and the labeled NSCs and BMSCs were found in spinal cord slices. Conclusion Intravenous injection of NSCs or BMSCs can improve motor function in rats with spinal cord injury， and the treatment effect is more obvious in NSCs group. The combination of two stem cells may have better therapeutic effect.

【Key words】Neural stem cells； Bone marrow-derived stem cells； Spinal cord injury； Rat； BBB score

通讯作者：△赵廷宝，博士后，主任医师，教授，博士研究生导师，现任济南军区总医院全军创伤骨科研究所副所长兼脊髓修复科主任，研究方向：脊柱外科，骨缺损修复。E-mail：doctorzhaotingbao@163.com

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)09-0015-03