冀书娟　康　康　李　浩

河南信阳市中心医院神经内科　信阳　464000

姜黄素对AD小鼠海马神经元凋亡和GSK-3β表达及磷酸化的影响

冀书娟康康李浩

河南信阳市中心医院神经内科信阳464000

【摘要】目的观察姜黄素对AD小鼠模型海马神经元凋亡和糖原合成酶激酶3β表达及其磷酸化影响。方法将20只APP/PS1转基因小鼠随机分为AD模型组、AD模型+姜黄素组，每组10只，AD模型+姜黄素组腹腔注射剂量为400 mg/(kg·d)姜黄素，1次/d，连续14 d。取12只正常小鼠作对照组。采用扫描电镜检测小鼠海马神经元凋亡，Western blot 检测GSK-3β、酪氨酸磷酸化GSK-3β(pTyr-GSK-3β)和丝氨酸磷酸化GSK-3β(pSer-GSK-3β)的表达情况。结果与对照组相比，模型组海马神经元出现染色质边集、线粒体肿胀、细胞器减少；pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β的表达明显增加(t=5.112，P=0.005；t=5.619，P=0.006)。与模型组相比，姜黄素组海马神经元染色质呈弥散分布、线粒体嵴清晰可见、细胞器排列紧密，pTyr-GSK-3β表达明显降低(t=-7.985，P=0.001)，pSer-GSK-3β表达明显提高(t=9.105，P=0.001)。结论GSK-3β可能参与AD小鼠海马神经元损伤，姜黄素通过减少pTyr-GSK-3β、增加pSer-GSK-3β的表达抑制GSK-3β活性来减少AD小鼠海马神经元凋亡。

【关键词】姜黄素；AD；海马神经元；糖原合成酶激酶-3β

阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)即老年痴呆，是一种慢性退行性神经疾病，以记忆减退和认知功能障碍为临床特征[1]。目前，临床上缺乏有效的治疗AD的药物，且不良反应较强，因此研发不良反应小的AD治疗药成为研究的热点[2-3]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，研究表明，GSK-3β可能与AD密切相关[4]。但姜黄素对AD引起的海马神经元损伤具有保护作用是否与GSK-3β相关，目前尚不清楚[2，5-6]。本实验初步探讨姜黄素对AD小鼠海马神经元凋亡和GSK-3β表达及其pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β蛋白表达的影响，为AD治疗提供新的靶点。

1材料与方法

1.1实验动物8月龄APP/PS1转基因小鼠20只及同龄正常小鼠10只，由天津医科大学动物中心提供，雌雄各半，体质量(20±2)g，适应性喂养1个月。

1.2主要试剂及仪器姜黄素、鼠抗人GSK-3β一抗、兔抗人pTy-GSK-3β一抗、兔抗人pSer-GSK-3β一抗、DAB显色试剂盒购自天津化学试剂公司。扫描电镜、电泳仪、光密度扫描仪购自美国。

1.3动物分组及处理将20只APP/PS1转基因小鼠随机分为2组，即AD模型组、AD模型+姜黄素组，AD模型+姜黄素组腹腔注射姜黄素，浓度为400 mg/(kg·d)，1次/d，连续14 d。同时选取10同龄正常小鼠做为对照组。

1.4检测指标及方法

1.4.1细胞凋亡检测：应用扫描电镜检测神经元凋亡，操作步骤取材、固定→切片(40 μm)→饿酸固定→脱水→树脂包埋→超薄切片→电镜观察。

1.4.2Western blot检测GSK-3β、pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β表达检测蛋白表达：-80 ℃取出脑组织，取50mg，提取总蛋白，蛋白含量测定，电泳→转模→封闭→一抗→孵育洗涤→二抗→显色→荧光系统扫描→分析。

1.5统计学处理应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，计数资料以率(%)表示，采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组海马神经元凋亡情况比较与对照组相比，模型组海马神经元染色质出现边集，线粒体肿胀、嵴减少、出现空泡；与模型组相比，姜黄素组海马神经元核膜较清晰，粗面内质网增多，线粒体嵴较清晰。见图1。

图1　3组扫描电镜情况比较

2.2各组GSK-3β、pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β蛋白表达的比较与对照组相比，模型组GSK-3β总量差异无统计学意义(t=0.975，P=0.412)，pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β表达水平均明显升高(t=5.112，P=0.005；t=5.619，P=0.006)；与模型组相比，姜黄素组GSK-3β表达水平差异亦无统计学意义(t=1.37，P=0.19)；姜黄素组pTyr-GSK-3β表达水平明显降低(t=-2.994，P=0.017)，pSer-GSK-3β表达水平明显升高(t=4.009，P=0.017)。见表1、图2。

表1　各组GSK-3β、pTyr-GSK-3β、pSer-GSK-3β

注：与对照组比较，❋P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

图2　各组GSK-3β、pTyr-GSK-3β、PSer-GSK-3β蛋白表达

3讨论

姜黄素是中药姜黄中的有效成分，现已证实其具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，其对AD的保护作用近年来备受青睐[7-8]。本次实验发现，AD小鼠模型的海马神经元细胞凋亡现象明显。我们给予AD小鼠400 mg/(kg.d)姜黄素，虽然未能完全消除AD引起的细胞凋亡，但其凋亡情况明显好于模型组，与模型组比较，核膜、线粒体嵴较清晰，这一现象表明，姜黄素可能减少海马神经元的凋亡。

GSK-3β是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，具有广泛的生理作用，参与细胞增值、凋亡等过程，分子量为47Kd。GSK-3β具有双向调节的特性，第216位上的酪氨酸磷酸化使其活性增强，反之减弱；第9位上的丝氨酸磷酸化使其失活，反之增强[9-11]。GSK-3β的活性受到抑制或者失活，会抑制线粒体通透性转换孔(mPTP)开放[11-13]，阻止细胞色素C释放到胞浆中，从而阻止casPase级联反应，进而抑制细胞凋亡[14-15]。本次实验发现，AD上调PTyr-G S K-3β和PSer-GSK-3β的表达，提示GSK-3β磷酸化参与海马神经元的AD损伤。姜黄素组的GSK-3β表达水平无明显变化，但可上调PSer-GSK-3β和下调PTyr-GSK-3β的表达，提示姜黄素通过上调PS er-GSK-3β和下调PTyr-GSK-3β的表达而抑制GSK-3β的活性，从而减少AD海马神经元凋亡，减轻、延缓AD进程。

4参考文献

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(收稿2015-04-27)

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)09-0037-02