黄嘉膂，陈珺，张柳成，吴钧翔，吴毓俭，宋宁



·综述·

长链非编码RNA与精子发生

黄嘉膂，陈珺，张柳成，吴钧翔，吴毓俭，宋宁△

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的不编码蛋白的RNA分子。近年来的研究发现，lncRNAs在转录水平、转录后水平以及表观遗传水平广泛参与调控基因表达以及染色质重塑等。简述lncRNAs的分类与3种主要的作用机制（诱导、引导和支架），总结近年来通过二代测序技术以及基因芯片技术鉴定到的在精子发生过程中表达的lncRNAs，重点介绍Mrhl、Tsx、HongrES2、Dmr、Tbca16、NLC1-C等lncRNAs在生殖细胞增殖、分化、成熟过程中的功能及作用机制，并对lncRNA的功能研究策略作出展望。

长链非编码RNA；精子发生；生殖细胞；表观遗传学；遗传学

【Abstract】Long non-coding RNAs（lncRNAs）are a group of RNA transcripts with longer than 200 nucleotides and without protein-coding capacity.Recently，itwas revealed that the lncRNAs could be involved in the regulation of gene expression at the transcriptional，post-transcriptional and epigenetic levels，and chromatin remodeling.In this review，we summarized the classification of lncRNAs and three majormechanisms including decoys，guides and scaffolds.More and more lncRNAs related to spermatogenesis have been identificated by the next generation sequencing and microarray.The roles and potentialmechanisms of lncRNAs in the proliferation，differentiation and maturation of germ cells were introduced，including those lncRNAs as Mrhl，Tsx，HongrES2，Dmr，Tbca16 and NLC1-C.Finally，the study strategy of lncRNAswas discussed.

【Keywords】Longnon-codingRNAs；Spermatogenesis；Germ cells；Epigenetics；Genetics

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：317-321，326）

基金项目：国家自然科学基金（81501307）；上海交通大学医学院第九期大学生创新训练项目（2015013）

作者单位：200025上海交通大学医学院2013级八年制（黄嘉膂，陈珺，张柳成，吴钧翔，吴毓俭），解剖学与组织胚胎学系，上海市生殖医学重点实验室（宋宁）

通信作者：宋宁，E-mail：ningsong@shsmu.edu.cn

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审校者

精子发生（spermatogenesis）是一个复杂且受到精确调控的生殖细胞增殖、分化过程，涉及多种基因的调控、染色体重塑及其他多种因素的共同作用［1］。以小鼠为例，在有丝分裂期，一部分精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）分裂形成Apr型（type A-paired）精原细胞，进而形成Aal型（type A-aligned）精原细胞，后者通过数次有丝分裂和分化，依次产生A1～A4型精原细胞、中间型细胞、B型精原细胞以及初级精母细胞。在减数分裂期，初级精母细胞的染色体完成复制，并发生同源染色体联会和交叉互换，经第一次减数分裂形成两个次级精母细胞，后者不发生染色体复制即快速进入减数分裂Ⅱ期，形成4个单倍体的圆形精子细胞。而在精子形成期，圆形精子细胞的染色质高度浓缩，高尔基体转变为顶体，同时伴随轴丝、鞭毛和线粒体鞘等结构的发生，经历复杂的形态变化后，最终发育为具有头、颈、尾完整结构的精子［1］。近年来，长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）作为转录组中的重要成员，在精子发生以及相关疾病中的作用被不断发现，引起越来越多的关注。

1　lncRNAs概述

随着基因组计划的完成和第二代测序技术的应用，学者们发现人类基因组中高达98.5%的转录物不具有蛋白质编码功能［2］。这些非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）包括熟知的“管家”非编码RNA［如核糖体RNA（rRNA）］、小非编码RNA［如微小RNA （miRNA）和Piwi相互作用RNA（piwi interacting RNA，piRNA）］以及长度大于200个核苷酸（nt）的lncRNA。与信使RNA（mRNA）相似，lncRNA主要由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，具有5’帽结构，但在人基因组已知的9 640条lncRNA中，仅16.8%具有3’poly A尾结构［3］。lncRNA的进化保守性差，分子内部常折叠形成复杂的二级结构，且其表达具有明显的组织和阶段特异性，某些lncRNA还具有特定的亚细胞定位［4］。根据lncRNA在基因组中与邻近蛋白质编码基因的位置和相对方向，一般可将其分为5类：正义（sense）lncRNA、反义（anti-sense）lncRNA、双向（bidirectional）lncRNA、内含子（intronic）lncRNA和基因间（intergenic）lncRNA［5］。

在目前已知的lncRNA调控方式中，其作用主要通过转录水平、转录后水平和表观遗传水平呈现［6］。在转录水平，lncRNA可通过干扰邻近基因的表达、与转录因子或RNA聚合酶Ⅱ相互作用、与DNA碱基互补形成复合物以及作为内源性竞争性RNA （competing endogenous RNA，ceRNA）调控靶基因的转录［7］。在转录后水平，lncRNA可与miRNA结合抑制miRNA功能，或调控mRNA的可变剪接，也可与mRNA互补配对形成双链RNA，改变其稳定性［8］。在表观遗传水平，lncRNA可通过DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重构等机制影响基因表达。其中lncRNA调控自身基因所在染色体上基因表达的方式称为顺式调节（in cis），如Xist、Air和Kcnq1ot1等；而远距离调控其他染色体上基因表达的方式称为反式调节（in trans），如HOTAIR等［9］。

lncRNA的作用至少可分为诱导（decoys）、引导（guides）和支架（scaffolds）3种模式。诱导作用主要是通过lncRNA与DNA结合形成RNA-DNA杂交体，掩盖DNA上的蛋白结合位点，从而阻碍效应蛋白与相应DNA位点的结合，如lncRNA PANDA与凋亡前转录因子NF-YA相互作用从而参与DNA损伤致细胞凋亡的调控。引导作用是通过lncRNA与RNA结合蛋白相结合，并选择性引导蛋白复合体至特定位点，从而实现对基因表达的调节，如Xist介导的雌性哺乳动物X染色体的失活。支架作用是指lncRNA可通过其分子内的不同结构域，以中心支架的形式聚集两个或以上蛋白质成分形成特定复合体，如lncRNA HOTAIR使LSD1/CoREST/REST组装形成二级复合体对染色体修饰进行调控［10］。

lncRNA的研究尚处于起步阶段，但其多样的生物学功能已引起学者们的关注。lncRNA不仅与多种疾病（如肿瘤、神经退行性疾病）之间有密切联系［11］，还参与调控生物体内许多重要的生命活动，例如热休克反应和基因组印迹等。近年来，lncRNA在精子发生过程中的独特作用也逐渐被学者们所知。

2　lncRNAs参与调控精子发生

精子发生过程中，调控性非编码RNA的功能越来越受到重视，包括miRNA、piRNA、小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）和lncRNA［10-11］。前三者为长度小于50 nt的小非编码RNA，其中miRNA通过与靶mRNA的3’非翻译区（3’untranslated region，3’-UTR）结合，抑制其翻译水平或降低其稳定性，最终减少蛋白表达；piRNA能够与miwi、miwi2和mili等3种piwi蛋白相结合，主要起沉默反转录转座子（retrotransposons）的作用，也可与真核生物的起始因子eIF相结合，从而抑制蛋白质的翻译，在精原干细胞的自我更新和精子细胞发育中必不可少［12］；siRNA能与RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，继而识别并附着于互补的靶mRNA，使其降解，引发的转录后基因沉默现象称为RNA干扰（RNA interference）。

2013年，Sun等［13］利用微阵列技术（microarray）对幼年小鼠和成年小鼠的睾丸转录组进行了检测，发现有3 025种lncRNA存在明显的表达差异，其中1 062种下调，1 963种上调。Bao等［14］选取雄性小鼠在胚胎及出生后的6个关键时间点（胚胎第12.5天、胚胎第15.5天、新生第7天、新生第14天、新生第21天以及成年），通过分离纯化生殖细胞，得到去甲基化和再甲基化的原始生殖细胞（primordial germ cell，PGC）、精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞以及精子，通过基因芯片技术对31 423种lncRNA的表达进行分析，发现相邻两个时间点之间约500～3 000 种lncRNA的表达发生显著变化（改变倍数＞2），且改变超过10倍的lncRNA多位于出生后14天（p14）→p21和p21→成年（AD）两个时期内，表明lncRNA的调节在精子发生的减数分裂晚期和单倍体时期尤为多样。此外，从胚胎第12.5天（E12.5）到E15.5，lncRNA的表达上调数（2 593）多于下调数（1 125），而从p21到AD，其表达下调数（3 096）多于上调数（1 976），该结果与2个时间窗中的总体转录活动一致，表明lncRNA的转录受到调控，或者lncRNA在mRNA的转录过程中发挥作用。而Liang等［15］的研究发现，在小鼠睾丸的24 316种lncRNA中，每条染色体上的lncRNA表达量均在1 000种左右，但Y染色体上仅表达30种，暗示lncRNA在性别差异中可能的调节作用。进一步将lncRNA分为正义、反义、双向和基因间4组，发现基因间lncRNA占绝大部分，且其表达量在不同发育阶段的生殖细胞中变化巨大，因此研究人员推测其由组织特异性基因编码；而前3种lncRNA数量少、变化小，被认为由管家基因转录而得，影响整个精子发生过程。

3几个与精子发生相关的重要lncRNAs

3.1M rhl（meiotic recombination hot spot locus）

是一种定位于细胞核中的长2.4 kb的单外显子lncRNA，由小鼠8号染色体上的减数分裂重组热点位点编码而得，其同源基因也见于大鼠的19号染色体，但在人类基因组中尚未发现［16］。Ganesan等［17］研究发现，在Drosha的作用下，Mrhl可被剪接成一个80 nt大小的中间体RNA，且两者均分布于GC1精原细胞系的核仁中，提示2种RNA可能与染色质发生相互作用。Akhade等［18］运用ChOP（chromatin oligo affinity precipitation）技术对小鼠精原细胞进行染色质的全基因组分析，发现1 370个与Mrhl相关的基因位点，其中37个基因位点的表达在Mrhl下调时发生显著改变。

Arun等［19］的进一步研究表明，Mrhl能够通过与Ddx5/p68蛋白的相互作用实现对小鼠精原细胞中Wnt信号通路的负调控。当Mrhl的表达下调时，酪氨酸磷酸化的p68蛋白从核内转运到胞质中，引发β-连环蛋白（β-catenin）向核内移位并且活化关键转录因子TCF4，形成的β-连环蛋白-TCF4复合物能够与目标基因启动子的Wnt反应元件（Wnt responsive elements，WRE）相结合，通过招募共激活因子（coactivators）或共抑制因子（co-repressors）调节相关基因表达。由于Wnt信号通路能够导致细胞分化，抑制细胞增殖，因此Mrhl在精原细胞的分裂和分化调控中发挥重要作用［20］。

3.2Tsx（testis-specific X-linked）Tsx基因位于X染色体失活中心（X-inactivation center，Xic），紧邻Xite上游，其进化前体为脊椎动物的Fip112基因。人和小鼠的Tsx基因具有高度同源性，尤其是在外显子1，3，4，5和6区域［21］。Anguera等［22］的实验表明，体外克隆Tsx基因并构建的表达载体，无论是在无细胞翻译系统（cell-free translation system）中，还是转染人293T细胞和小鼠胚胎干细胞后，均未检测到蛋白质的表达。Tsx是在生殖细胞、胚胎干细胞和脑中高表达一种lncRNA，在减数分裂期的生殖细胞（尤其是粗线期精母细胞）中表达最多。但值得注意的是，该时期的性染色体处于广泛的失活状态，称为MSCI（meiotic sex chromosome inactivation），仅有少量基因能够逃避转录沉默，Tsx基因即为其中之一，也提示Tsx在精子发生中可能存在重要的调控作用。Tsx基因的敲除不影响MSCI，也不影响雄性生育，但敲除小鼠表现出一系列的生殖缺陷，包括粗线期细胞大量凋亡、睾丸体积变小、子代体质量减轻等。

3.3HongrES2是一种特异表达于附睾的lncRNA，长1.6 kb，由来自于大鼠的5号和9号染色体的转录物嵌合形成。其表达起始于大鼠出生后第30天，即第1轮精子发生刚刚完成时，随后逐渐增高，到第450天时趋于稳定，整个过程受雄激素的调控影响。这种表达的时空特异性提示其在精子成熟中的可能作用。与mRNA类似，HongrES2也具有5’端帽子和3’端poly A尾结构，且其3’端一段长为216 bp的序列与附睾特异编码基因羧酸酯酶7 （carboxylesterase 7，CES7）具有高度同源性。HongrES2在细胞核中能够被加工成一种23 bp长且类似于miRNA的小RNA，称为mil-HongrES2，后者能够抑制CES7的表达，影响胆固醇酯酶的活性，从而通过降低精子膜中胆固醇/磷脂类的比例，加强膜的流动性，有利于精子获能（capacitation）［23］。有趣的是，细胞核中mil-HongrES2的含量很少，而其前体HongrES2的含量却很多，表明核内可能存在一种未知的剪切抑制机制。进一步的实验表明，mil-HongrES2的过量表达也会引起细胞内酪氨酸的广泛磷酸化，而后者是与精子获能相关的信号级联激活的标志。因此，HongrES2的内源性低表达是附睾中精子正常成熟所必需的条件之一［24］。

3.4Dm r（Dm rt1-related）是一种高表达于睾丸的lncRNA，其基因位于小鼠5号染色体的G2位点和大鼠12号染色体的p11处。Zhang等［25］研究发现，Dmr基因能够与来自小鼠19号染色体的Dmrt1（Dsx-and Mab3-related transcription factor-1）基因反式剪接，形成新的Dmrt1-Dmr嵌合转录物。其中Dmr主要作为3’-UTR提供终止密码子TGA，使翻译的Dmrt1蛋白长度缩短，羧基末端缺失，仅保留一个保守的DNA结合结构域DM。同时由于反式剪接的形成，Dmr也在一定程度上下调了Dmrt1蛋白的表达。

值得注意的是，Dmrt1蛋白除了作为性别决定的关键因子，也已经被证实在精子发生调控中发挥着重要作用。一方面，该蛋白能够阻断维甲酸（retinoic acid，RA）依赖性的STRA8因子表达，并间接抑制RA的相关转录活动，从而抑制精原细胞由有丝分裂期进入到减数分裂期；另一方面，Dmrt1也能

直接激活转录因子SOHLH1的表达，维持支持因子的周期性表达，进而促进精原细胞的发育进程［26］。Agbor等［27］则通过特异性敲除支持细胞中的Dmrt1基因发现，Dmrt1能够通过影响支持细胞的成熟而对精子发生产生影响。因此，Dmr作为Dmrt1的抑制因子，可能参与调控精子发生过程。

3.5Tbca16精子发生的过程涉及到微管与细胞骨架的精确重构，从而产生复杂的微管结构，如精子颈部和鞭毛等，而有丝分裂和减数分裂的顺利进行也同样需要微管的参与［28］。在微管的形成过程中，微管蛋白辅助因子A（tubulin cofactor A，TBCA）通过与β亚基结合，参与微管蛋白异二聚体的形成以及进一步的微管组装。通过RNA干扰技术抑制其表达，可导致α和β亚基数量减少、微管细胞骨架结构改变和G1细胞周期阻滞，甚至引起细胞死亡［29］。Nolasco等［30］研究发现，小鼠基因组中含有2种不同结构的Tbca基因，分别位于13号和16号染色体。其中Tbca13基因通过转录、翻译产生TBCA蛋白发挥作用，在小鼠精子发生过程中其mRNA的表达水平逐步提高；而Tbca16基因位于腺苷酸环化酶9 （adenylate cyclase 9，Adcy9）基因的内含子3～4之间，其表达水平逐渐降低，与Tbca13基因相反，因此推测这2种基因之间可能存在某种调节机制。进一步研究表明，Tbca16基因不编码蛋白，而是同时转录生成正义和反义RNA，即mRNA和NATs（naturalantisense transcripts），后者为lncRNA Tbca16。两者能够互补配对形成双链RNA，作为前体物质被加工生成siRNA。由于Tbca13和Tbca16基因的编码区域序列具有高达98%的相似性，因此形成的siRNA能够使Tbca13的mRNA发生降解，诱导基因沉默，通过抑制TBCA蛋白的合成，在转录后水平影响精子发生。

3.6NLC1-C精子的成熟阻滞（maturation arrest，MA）是临床上男性不育的常见原因。Lü等［31］通过微阵列分析技术发现，健康对照者与MA患者的睾丸lncRNA表达谱之间存在明显差异。其中NLC1-C是一种仅表达于精原细胞和早期精母细胞的基因间lncRNA，在正常情况下主要表达于细胞质，而在MA患者中，尽管其总体表达量降低，但在细胞核中的表达反而上调。体外细胞试验表明，NLC1-C在NT2细胞质中的过表达能够促进细胞增殖，而相应基因的敲除则抑制细胞增殖并促进凋亡。进一步的实验发现，在正常小鼠的睾丸中，NLC1-C能够特异性地结合于核仁素（nucleolin）的RBD结构域，共同抑制miR-320a和miR-383的转录形成，而当被转运至胞质中后，加工成熟的miR-320a和miR-383则能够直接抑制NLC1-C的作用，从而对细胞生存进行调节。因此，细胞核内NLC1-C的表达升高，可以加强对miR-320a和miR-383的转录抑制，导致精原细胞和初级精母细胞的过度增殖以及成熟阻滞，与男性不育的发生密切相关。NLC1-C还在睾丸胚胎癌细胞的胞核中高表达，影响细胞的增殖和凋亡，与不育男性多发睾丸癌的结果相一致［32］。

3.7其他相关的lncRNAs Luk等［33］通过对SAGE数据库和全基因组嵌合微阵列（whole-genome tiling microarray）数据库进行筛选，发现2种特异表达于精原细胞的lncRNA，分别命名为Spga-lncRNA 1和2。两者在体内模型中均表现出显著的分化抑制作用，表明其在精原细胞的干性维持（stemness maintenance）中可能发挥重要作用。

人NEAT1（nuclear enriched abundant transcript 1）是一种转录自11号染色体的lncRNA，作为核心组分参与旁斑（paraspeckle）结构的形成，而后者能够阻滞成熟mRNA的出核和后续翻译，参与调控细胞的生长和分化［34］。研究人员通过构建针对NEAT1的干扰载体并包装慢病毒，将其注射到成年小鼠睾丸的曲细精管中，结果发现有精子发生的曲细精管比例由97%减少至86%，表明小鼠的精子发生受到影响，具体机制尚不明确［35］。

大量证据显示线粒体功能与精子质量和受精能力密切相关，精子线粒体活性已成为影响人类精子生理功能的重要标志［36］。与核基因组不同，双链环状的线粒体DNA只能编码与电子传递链相关的13种蛋白亚基，以及翻译所需的2种rRNA和22种tRNA［37］。Rackham等［38］的研究发现线粒体也能表达3种lncRNA，分别为lncND5、lncND6和lncCytb，三者均由核编码蛋白（如MRPP1和PTCD1）调控其加工过程。进一步对18种人体组织进行分析发现，线粒体lncRNA在生殖系统组织（如睾丸和卵巢）中的表达量最高，提示其在精子发生等生殖活动中可能发挥重要作用。而其作用机制可能与lncRNA分子内部形成的二聚体结构有关。该结构能够与其互补配对的mRNA相结合，从而增加mRNA的稳定性或者调节其翻译水平，通过影响线粒体的功能而影响精子发生。

4结语与展望

综上所述，越来越多的lncRNA被发现与精子发生紧密相关，并参与雄性生殖细胞增殖、分化的调控过程。lncRNA通过多种方式在不同水平调控基因表达，在精子发生这一精密调控的过程中构建了一个复杂的调控网络。然而，由于实验技术等限制，对这一领域的研究尚待进一步深入。例如，由于lncRNA在转录组中的表达量很低，早期研究为了富集尽可能多的RNA以方便测序，往往首先使用poly A尾富集技术，这一策略人为地将无poly A的lncRNA排除在外。最近的研究显示，无poly A尾的lncRNA数量远多于有poly A尾的lncRNA。另外，由于已知的lncRNA种类多达数十万种，如何对其进行功能研究是一个巨大的挑战，在这方面，大数据分析、组学研究、CRISPR-Cas9敲除等新型研究方法的应用，应能对开拓研究方向、缩短研究周期起到积极的帮助。同时，与miRNA不同的是，大部分lncRNA物种间保守性差，这些lncRNA只是“垃圾”RNA亦或存在未知的功能需要进一步的探索，一个可能的解释是不保守的lncRNA间存在共同的功能域。随着实验技术的不断发展、各种临床检测技术的不断成熟以及对不同lncRNA功能的进一步理解，lncRNA很有可能在男性生殖系统疾病的诊断治疗中成为新的生物标记物或治疗靶点，为广大患者带来福音。

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［本文编辑王昕］

Role of Long Non-coding RNAs in Spermatogenesis

HUANG Jia-lv，CHEN Jun，ZHANG Liu-cheng，WU Jun-xiang，WU Yu-jian，SONG Ning.Departmentof Clinical Medicine，Grade 2013（HUANG Jia-lyu，CHEN Jun，ZHANG Liu-cheng，WU Jun-xiang，WU Yu-jian），Department of Anatomy，Histology and Embryology/Shanghai Key Laboratory of Reproductive Medicine（SONG Ning），School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200025，China

SONG Ning，E-mail：ningsong@shsmu.edu.cn

·综述·

（2016-03-01）