王勇，汤育新，阳建福，段燚星

（1.湖南省人民医院 泌尿外科，湖南 长沙 410005；2.中南大学湘雅三医院 泌尿外科，湖南 长沙 410013）

精原细胞瘤是睾丸生殖细胞肿瘤最常见的类型，约占总数的55%，其发病机制仍未阐明，对相关发病基因进行筛选及功能研究是目前的热点。TDRG1（testis development related gene 1）是笔者通过“数据库削减杂交技术”克隆并证实的睾丸特异性基因，其表达的组织特异性及时间特异性与精原细胞瘤的发病特征相吻合，提示TDRG1可能是精原细胞瘤的发病相关基因。因此，本研究应用大样本的精原细胞瘤组织芯片，通过免疫组织化学染色的方法对TDRG1的表达进行了检测，并首次对TDRG1与精原细胞瘤患者年龄及肿瘤TNM分期等病理参数的相关性进行了分析，希望能够为精原细胞瘤提供新的研究思路及可能的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用组织芯片购于西安艾丽娜生物科技公司，共包含106例精原细胞瘤组织及35例正常睾丸组织，相关临床病理资料由西安艾丽娜生物科技公司提供，其中正常睾丸组织主要为严重睾丸外伤患者行睾丸切除术及前列腺肿瘤患者行手术去势治疗所切除的睾丸组织，相关实验已获得湖南省人民医院伦理委员会批准。纳入研究的106例精原细胞瘤患者，年龄15～80岁，平均年龄41.5岁，根据睾丸生殖细胞肿瘤TNM分期进行分类，T1期62例，T2期32例，T3期2例，T4期10例。

1.2 试剂与方法

应用免疫组织化学染色法对组织芯片进行染色，经过脱蜡、浸水和水化后，将芯片置于95℃柠檬酸钠溶液中抗原修复20 min，冷却至室温。用山羊血清室温下封闭25 min，滴加一抗即TDRG1单克隆抗体（湖南远泰生物技术公司，1︰5 000稀释），放入湿盒中4℃过夜，然后以pH7.2磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）冲洗3次，按照免疫组化试剂盒KIT-5020（福州迈新生物公司）说明书进行二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显色。

1.3 结果判定

在每个标本病变典型处随机选取5个不重叠的高倍视野（HPF×400），将胞浆内出现的棕黄色染色标记为TDRG1阳性表达，通过图像分析软件Motic Fluo 1.0测量棕黄色染色面积的光密度值，取平均值代表该样本 TDRG1的表达水平。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用样本均数间t检验进行分析；计量资料与等级资料间相关性分析采用Spearman检验，计量资料间相关性分析采用Pearson检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TDRG1在精原细胞瘤和正常睾丸组织中的表达

研究结果显示，TDRG1在正常睾丸和精原细胞瘤组织中均有表达，见图1。在正常睾丸组织中，TDRG1主要表达在生精细胞内；在精原细胞瘤组织中，TDRG1主要表达在肿瘤细胞的胞浆中，在肿瘤间质中未见明显表达。TDRG1在精原细胞瘤中的表达明显高于正常睾丸组织，差异具有统计学意义，见图2。

图1 正常睾丸组织及精原细胞瘤组织TDRG1免疫组织化学染色（×400）

图2 TDRG1在正常睾丸及精原细胞瘤组织中的表达

2.2 TDRG1的表达与精原细胞瘤TNM分期等参数的关系

研究结果显示，TDRG1在精原细胞瘤不同TNM分期中的表达具有明显差异，见图3。TDRG1表达水平与精原细胞瘤TNM分期存在正相关性（r =0.877，P＜0.001），见图4。TNM分期越高，TDRG1表达水平越高。TDRG1的表达水平与精原细胞瘤患者的年龄无明显相关性（r =0.101，P =0.301＞0.05），见图 5。

图3 TDRG1在精原细胞瘤不同TNM分期中的表达分析

图4 TDRG1表达与精原细胞瘤TNM分期的相关性分析

图5 TDRG1表达与精原细胞瘤患者年龄的相关性分析

3 讨论

近年来，睾丸生殖细胞肿瘤的发病率呈逐年递增的趋势，其发病隐匿，多见于青壮年，若不能及时诊断和治疗，会很快发生扩散转移，严重影响患者的生殖健康甚至生命[1]。睾丸生殖细胞肿瘤可分为精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎癌以及卵黄囊瘤等，其中精原细胞瘤是最为常见的类型[2]。形态学、细胞超微结构、细胞遗传学分析表明精原细胞瘤可能是睾丸生殖细胞肿瘤共同的前身病变[3-5]，因此对精原细胞瘤进行研究有助于阐明睾丸生殖细胞肿瘤的发病机制。众所周知，肿瘤的发病是一个多基因参与的复杂过程，虽然目前推测P53、Bcl-2等基因可能与精原细胞瘤的发病相关[6]，但精原细胞瘤的发病机制仍不清楚，说明可能有未知基因参与其发病过程，因此对新的发病相关基因进行筛选和功能研究具有重要的临床意 义。

TDRG1是笔者运用“数据库消减杂交”方法克隆的新基因，GenBank登录号为DQ168992，定位于6p21.2-p21.2，全长1197 bp，开放阅读框为504～806 bp，其编码的蛋白由100个氨基酸组成，分子量为10 KD，等电点为6.81，通过Blast检索nr数据库以及氨基酸序列同源比较分析显示TDRG1基因及蛋白与其他已知蛋白质无同源性，表明该基因及其产物均是全新的[7]。本研究前期试验中，首先制备了高效价的小鼠抗人TDRG1单克隆抗体[8]，进而通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）的方法证实TDRG1仅表达于人睾丸组织，在人心脏、肝、脑、肺、肾、脾、附睾等组织中无表达，表明TDRG1的表达具有明显的组织特异性。与此同时，发现TDRG1的表达还具有年龄特异性，即在青壮年男性的睾丸组织中高表达[9]，TDRG1的这些表达特点与精原细胞瘤的发病特征相吻合，提示TDRG1可能是精原细胞瘤的发病相关基因。在肿瘤的发病中，分子信号通路发挥着重要作用，Kemmer等[10]研究认为KIT/PI3K/AKT通路的异常激活存在于大多数精原细胞瘤中，说明KIT/PI3K/AKT通路是精原细胞瘤发病过程中主要的信号通路，并且有独特的意义。前期的试验中，笔者在2010年曾经应用组织芯片对TDRG1的表达进行过初步检测[11]，但样本量较小（n =26），结果显示TDRG1在精原细胞瘤中表达低于正常睾丸组织，可能为抑癌基因。随着后续研究的深入，Western Blot、PCR以及细胞学实验发现TDRG1可以通过PI3K/AKT/mTOR通路促进精原细胞瘤TCam-2细胞增殖，具有癌基因的潜能[12]，这与笔者前期小样本精原细胞瘤组织芯片的实验结果是矛盾的。因此为了进一步研究TDRG1与精原细胞瘤的关系，在本实验中，应用大样本的精原细胞瘤组织芯片（n =106例）对TDRG1的表达进行了检测，结果发现TDRG1在精原细胞瘤组织中的表达水平明显高于正常睾丸组织（P＜0.001），与精原细胞瘤TCam-2细胞学实验的结果是一致的，两者相互佐证，证实TDRG1可能是精原细胞瘤发病相关基因，具有癌基因潜能。目前为止尚无研究对TDRG1与精原细胞瘤患者肿瘤分期等临床参数的相关性进行分析，为了进一步探讨TDRG1在精原细胞瘤中的临床意义，在本实验中还首次对TDRG1与精原细胞瘤患者年龄及TNM分期的相关性进行了分析，结果显示TDRG1的表达与患者的年龄无明显相关性，但TDRG1的表达水平与精原细胞瘤的TNM分期存在强正相关性，TNM分期越高，TDRG1的表达水平越高，表明TDRG1可能参与了精原细胞瘤的发展过程。由于该组织芯片缺少患者生存期等临床资料，且淋巴结转移患者数目较少，因此TDRG1与精原细胞瘤患者生存期、淋巴结转移等的相关性以及TDRG1是否能够作为精原细胞瘤的预后判断指标还有待于进一步研究。

综上所述，本研究主要是应用组织学的方法对TDRG1与精原细胞瘤的关系进行了初步探讨，笔者认为TDRG1可能作为癌基因通过参与精原细胞瘤的发病过程，其作用机制还有待于进一步的深入研究。此外，蛋白在细胞内的定位与其功能是密切相关的，本实验发现TDRG1主要表达在正常睾丸组织的生精细胞及肿瘤细胞的胞浆中，但TDRG1的亚细胞定位仍不清楚，因此在后续的研究中，将应用免疫电镜等方法对TDRG1的亚细胞定位进行分析，以更加全面深入地阐述TDRG1的作用机制和生物学功能。