欧阳小娥，胡蓉



·综述·

氧化应激对卵母细胞发育及体外受精-胚胎移植结局的影响

欧阳小娥，胡蓉△

卵母细胞及胚胎发育的微环境中，由氧气参与新陈代谢所产生的一些活性氧物质如得不到及时清除，会诱导氧化应激的现象。有研究显示，氧化应激是影响卵母细胞质量和胚胎发育潜能的主要因素之一，大量的氧化应激可导致卵母细胞内线粒体形态和功能的改变，进而影响三磷酸腺苷（ATP）合成，干扰卵母细胞内减数分裂，使卵母细胞内非整倍体染色体数目增多，造成胚胎DNA损伤和早期发育停滞，最终导致不良妊娠结局。在体外培养时，经常通过添加外源性抗氧化剂或自由基清除剂，以及建立并维持卵母细胞及胚胎发育所需的低氧环境来拮抗氧化应激的不良作用。就氧化应激的产生、对卵母细胞和胚胎发育的影响及其机制，以及如何拮抗氧化应激的不良影响进行综述。

活性氧；氧化性应激；卵母细胞；受精，体外；胚胎移植；妊娠结局

【Abstract】Some of reactive oxygen species（ROS）were produced in themicroenvironment of oocyte and embryo when oxygen participates in the metabolism.If not eliminated in time，ROS can directly induce the oxidative stress.Studies have shown that the oxidative stress is one of the dominant factors related to the oocyte quality.The excess oxidative stressmay lead to changes in the morphology and function ofmitochondria in the oocyte，the synthesis of ATP and themeiotic process.After that，the increasing oocyte aneuploidy and the damage of embryonic DNA may lead to the stagnation of embryonic development and the poor outcome of pregnancy.In in vitro culture of oocyte and embryo，the adverse effects of oxidative stress can be well eliminated by adding exogenous antioxidants or free radical scavenger，and establishing and maintaining the hypoxic environment for the development of oocyte and embryo.This article reviewes the onset of oxidative stress，the effect on the development of oocytes and embryo and the mechanisms involved，and how to overcome the adverse affect of oxidative stress.

【Keywords】Reactive oxygen species；Oxidative stress；Oocytes；Fertilization in vitro；Embryo transfer；Pregnancyoutcome

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：299-302，312）

随着自由基理论的建立和发展，研究发现氧的某些代谢产物及其衍生物可以损伤机体，这些物质具有比氧更为活泼的化学性质，统称为活性氧（ROS）。ROS分为3种类型：超氧自由基（O2-）、羟基（OH-）和过氧化氢（H2O2）。正常卵及胚胎发育需要身体内外环境因素的共同调节，当发生调节失衡可导致卵母细胞及胚胎发育异常，从而影响妊娠结局。过去近20年中对卵母细胞及胚胎发育的研究，主要局限在卵泡内细胞因子的调节和卵泡池的老化等指标。而随着分子生物学技术的发展，对氧化应激的研究已日趋完善。此外，随着体外受精-胚胎移植（IVF-ET）技术的进一歩发展应用，辅助生殖技术已成为治疗不孕症的最有效办法之一，其使命是尽最大限度地以最小的干预为患者提供最高的单胎活产率。本文旨在探讨如何在卵母细胞和胚胎发育早期采取非侵入性的手段建立并维护卵母细胞和胚胎发育所需适合的微环境，进一步选择具有较强发育潜能的胚胎进行移植，从而获得更好的妊娠结局。

基金项目：国家自然科学基金（81260109）；2014年宁夏医科大学总医院特殊人才启动项目（XT201421）

作者单位：750004银川，宁夏医科大学（欧阳小娥）；宁夏医科大学总医院生殖中心（欧阳小娥，胡蓉）

通信作者：胡蓉，E-mail:hr7424@126.com

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审校者

1　氧化应激现象的产生

在IVF-ET中，卵母细胞和胚胎中ROS的产生主要有两个来源：一个是内源性由配子和胚胎自身代谢直接产生，如：氧化磷酸化过程和细胞凋亡；另一个是由周围环境即外源性因素造成，如：氧气浓度、吸烟、年龄和生育力低下［1］。此外有研究报道，当用限制应激、热应激分别干预卵母细胞和胚胎的成熟培养体系时，发现其也能诱导体系中氧化应激的产生。胚胎在体内发育与体外培养过程中的最大差异是周围环境中氧气浓度不同，所以正常生理条件下ROS在体内不断产生和被清除，使ROS浓度处于平衡状态；但体外发育的胚胎，一方面细胞氧化代谢的产物得不到及时清除，另一方面体外培养环境进一步诱发氧化应激，导致ROS蓄积，浓度升高，对卵母细胞和胚胎的发育产生毒性作用［2］。

2　氧化应激对卵母细胞发育的影响

卵母细胞发育过程中，一些因素如外周氧浓度升高，自由基清除剂缺乏［3］，制动应激和抗氧化酶含量降低，可通过某些途径造成卵细胞线粒体的损伤、三磷酸腺苷（ATP）缺乏、减数分裂异常和非整倍体染色体数目增加，进而损害卵母细胞及胚胎发育潜能。

2.1ROS对卵母细胞结构及生化反应的影响大量研究表明，过量ROS是造成脱氧核糖核酸（DNA）损伤的主要因素，因为ROS含量比较高，使得线粒体处于高氧化应激环境，由于缺乏DNA修复应急机制，使得线粒体脱氧核糖核酸（mtDNA）突变率增加［4］。Estañ等［5］发现，三氧化二砷（As2O3）能导致ROS含量升高，造成线粒体中大量碱基被删除，使得mtDNA的复制数量明显减少。当用N-乙酰半胱氨酸处理后，能有效清除由As2O3诱导产生的ROS，减轻mtDNA受损的严重程度，增加培养基中卵母细胞内ATP含量。Burruel等［2］发现ROS的过度升高引起卵母细胞减数分裂停滞，继而发生凋亡，对卵母细胞成熟和后续胚胎发育造成不良影响。另有研究表明，超氧化物歧化酶（SOD）基因敲除后，诱导氧化应激使得孕酮分泌下降，进一步导致不孕和不良妊娠结局［6］。

2.2ROS介导制动应激对卵母细胞的损伤有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是卵母细胞成熟过程中对纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint，SAC）蛋白的表达和维持起关键作用的调控因子。研究发现孕妇受制动应激处理后，通过诱导卵母细胞内的氧化应激，降低MAPK的活性，进而干扰纺锤体组装和SAC的功能，且加快第1次减数分裂后期的进程，导致姊妹染色单体不分离和卵母细胞内非整倍体染色体数目增加［7］。另外，Lian等［7］研究制动应激大鼠模型，提出制动应激对卵母细胞发育的影响可能是因为氧化应激的产生而导致的。Zhou等［8］发现制动应激处理孕早期小鼠，子宫局部抗氧化相关酶的含量显著降低，而氧化产物的含量则显著增加，提示制动应激通过扰乱孕早期子宫局部的氧化应激平衡，诱导氧化应激的产生，进一步影响卵母细胞和胚胎的发育。

2.3ROS介导热应激对卵母细胞和胚胎发育的损伤目前已知热应激在实际生产中对家畜繁殖有影响，其不仅可通过影响母体输卵管和子宫环境影响卵母细胞和胚胎发育，还可直接影响受精后胚胎质量。Roth等［9］用流式细胞仪检测卵母细胞凋亡率时发现，40℃和41℃热应激组卵母细胞凋亡率高于38.5℃组，提示卵母细胞成熟期间热应激能诱导其凋亡，进而导致卵母细胞受精后早期胚胎发育潜能降低。另有学者通过研究热应激对机体以及生殖系统氧化、卵母细胞和植入前胚胎氧化及发育能力的影响，发现随着热应激温度升高和时间延长，肝脏和输卵管中总谷胱甘肽含量降低；当温度达到41℃时，卵巢和子宫中总谷胱甘肽降低，提示热应激诱导氧化应激的产生，进而启动抗氧化应激防御机制。已有研究证实，热应激能使胚胎内过氧化氢含量升高，抗氧化剂谷胱甘肽含量降低。在培养液中添加抗氧化剂可增强胚胎对热应激的耐受性，而抑制胚胎谷胱甘肽的合成会导致胚胎对热应激的耐受性降低。Zhang等［10］发现，相比未经热应激干预的对照组，实验组中受热应激处理后，大肠杆菌的代谢活性下降，ROS水平提高，乳酸脱氢酶活性和ATP水平降低。而生物技术合成的金纳米粒子通过增加谷胱甘肽、SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）的合成有效缓解热应激诱导的氧化应激不良反应。热休克蛋白（HSP）是胚胎对热应激做出保护性应答反应的主要产物之一，Zhu等［11］研究产妇饮食中补充锰元素能否克服热应激对胚胎发育的不良影响，通过观察比较常温和高温下胚胎的孵育率、抗氧化状态和HSP的表达水平，发现热应激能诱导氧化应激产生，使胚胎死亡率增加。补充锰增强胚胎抗氧化能力，克服热应激诱导氧化应激的不良效应，改善胚胎发育潜能。

3氧化应激对IVF-ET结局的影响

氧化应激是导致不孕及影响IVF-ET成功率的重要因素，其一方面可通过干扰卵母细胞的减数分裂［2］，诱导卵母细胞的退化和凋亡；另一方面通过产生过氧化物，造成胚胎DNA损伤和基因突变［3］。有学者发现，当减少抗氧化维生素，如维生素A、E、C等的补充时，机体抗氧化水平降低，且由于氧自由基产生增加造成胚胎DNA损伤，以及胚胎DNA损伤修复功能紊乱和缺陷［12］。有学者研究发现小鼠精子在80℃热水浴后，由于热应激诱导氧化应激产生，破坏了精子染色质的完整性，导致精子DNA去甲基化和组蛋白去甲基化过程失败，进而影响后续胚胎发育。

有研究表明，高氧环境下易产生更多的ROS导致胚胎DNA断裂、线粒体改变及蛋白氧化修饰等，从而影响受精和胚胎发育，导致不良妊娠结局［13］。Forristal等［14］通过对人类胚胎干细胞研究发现，低氧环境更利于维持人类胚胎干细胞的增殖和多能性。另有学者探究牛精子DNA碎片和氧化应激对早期胚胎体外发育结局的影响，实验分组按氧化应激强度大小依次为低、中、高、最高氧化应激组，之后检测各组中精子DNA的完整性和胚胎卵裂率，结果发现：随氧化应激强度增大，精子DNA完整性逐渐缺失，胚胎卵裂率逐渐下降，提示氧化应激能损害精子DNA完整性，进而损害胚胎质量，影响早期胚胎体外发育［15］。

4氧化应激对卵母细胞及胚胎发育造成危害的潜在机制

核因子κB（NF-κB）是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族，其作为信号传导途径中的枢纽，是氧化应激与子宫内膜细胞发育的桥梁，调控细胞凋亡及胚胎发育［16］。研究发现氧化应激产生的过量ROS，作为第二信使通过调节磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2），激活NF-κB信号通路诱导炎症和凋亡［17］。ROS可通过激活应激相关激酶如ERK1/2、应激激活的蛋白激酶（JNK）和p38，刺激NF-κB，诱导促炎因子的释放，也可以直接降解NF-κB抑制因子（IκB），激活NF-κB进入细胞核，与DNA控制元件结合最终导致DNA的断裂［17］。此外，NF-κB也可以调节抗氧化酶如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶-1的基因，促进ROS的产生［6］。

沉默信息调节蛋白1（Sirt1）属于烟碱腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，参与组蛋白和非组蛋白赖氨酸残基的去乙酰化，通过对p53、叉形头转录因子O亚型（FOXO）等进行去乙酰化作用，调控氧化应激、基因转录、衰老等系列过程。Hou等［18］采用Sirt1抑制剂EX-527证实内皮细胞经氧剥夺处理后，促红细胞生成素通过提高Sirt1蛋白表达而升高蛋白激酶（Akt）活性，并促进FOXO表达，同时还通过防止线粒体去极化，减少细胞色素C等活化线粒体途径降低氧化应激水平进而保护细胞。另有研究表明Sirt1通过FOXO的脱乙酰化作用，能刺激CAT和锰SOD（manganese-containingsuperoxide dismutase，MnSOD）的表达，从而避免氧自由基对细胞的损伤，保证卵母细胞减数分裂过程的正常进行［19］。

5　IVF-ET过程中如何拮抗氧化应激的不良作用

体外培养的胚胎发生发育阻滞的原因之一是环境氧浓度升高引起ROS蓄积，因为体外环境相比体内环境相对缺乏自由基清除剂。研究表明在IVFET过程中可以从两方面拮抗氧化应激的不良作用，一方面是机体自身抗氧化系统对氧化应激现象的拮抗作用，另一方面是在小鼠胚胎体外培养中加入外源性自由基清除剂如褪黑素、羧乙基锗倍半氧化物（Ge-132）和半胱氨酸等物质或建立并维持低氧环境（5%O2）。

5.1机体自身抗氧化系统对氧化应激现象的拮抗作用哺乳动物卵母细胞和胚胎内部存在多种抗ROS机制，主要分为非酶性抗氧化物和酶性抗氧化物。非酶性抗氧化物主要包括维生素A、维生素C、维生素E、谷胱甘肽、半胱氨酸等。酶性抗氧化物包括SOD、CAT、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）和过氧化物氧化还原酶（peroxiredoxin，PRDX）等，其能够加速超氧阴离子转变成过氧化氢，抑制电子传递到金属离子，避免形成羟基自由基。

5.2添加褪黑素对氧化应激现象的拮抗作用有研究表明褪黑素是一种高效的自由基清除剂，具有抗氧化作用，能够减少ROS损伤，提高猪孤雌胚胎体外发育的囊胚形成率、囊胚细胞数及减少细胞凋亡［20］。褪黑素对胚胎发育的促进作用部分归因于其能上调抗凋亡基因如B细胞淋巴瘤/白血病2基因（Bcl-2）的表达，和下调促凋亡基因如Bcl-2相关X蛋白基因（BAX）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （caspase-3），同时提高细胞内的谷胱甘肽水平及降低ROS水平［21］，这些作用可降低囊胚凋亡水平，提高胚胎质量及种植率。

5.3添加Ge-132对氧化应激现象的拮抗作用Ge-132

是有机锗化合物，具有抗氧化效应和抗癌效应。有学者发现，相比未添加Ge-132的对照组，实验组用

200μg/mLGe-132处理体外成熟卵母细胞后，胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平显著增加（P＜0.05），ROS含量显著下降，抗氧化相关基因——核转录因子2（Nrf-2）的信使RNA（mRNA）表达水平增高，凋亡基因Bax的mRNA表达水平降低［22］。

5.4添加半胱氨酸对氧化应激现象的拮抗作用半胱氨酸是一种还原剂，具有抗氧化抗衰老的作用，对卵母细胞的发育有一定的保护作用。研究发现，向卵母细胞体外成熟培养基中添加半胱氨酸可以降低ROS水平和减少非整倍体染色体，同时增加谷胱甘肽的合成和改善植入前后胚胎的发育［8］。Deleuze等［23］研究半胱氨酸对体外培养马卵母细胞成熟的作用发现，相比未添加半胱氨酸组，添加半胱氨酸组中卵母细胞原核形成率、卵裂率均表现出明显增高，胚胎发育情况也有明显改善。另有研究发现低温下添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸能降低氧化应激诱导的卵母细胞凋亡程度，进而阻止或延缓排卵后卵母细胞老化［24］。

5.5建立并维持低氧环境（5%O2）减少ROS的产生除添加抗氧化剂来减弱或消除氧化应激外，减少ROS的生成也是一种有效的方式，即从源头上拮抗氧化应激的不良作用。超氧阴离子来源于氧分子，所以降低培养环境中的氧浓度，能减少ROS的生成，从而减少氧化应激造成的氧化损伤。已有研究表明：相比5%O2，20%O2能加速培养液中ROS形成，诱导组蛋白修饰，使酶失活，膜脂过氧化，进而损伤胚胎膜表面，影响胚胎及胎儿发育［25］。Favetta等［26］将胚胎分别置于20%和5%的氧浓度下培养发现，前者细胞内H2O2浓度比后者增加了10倍，而在2-4细胞期胚胎发育停滞的发生率增长了2倍，提示建立并维持胚胎发育的低氧环境，可以降低外源性ROS的产生，提高胚胎发育潜能，提高妊娠率，改善辅助生殖结局。

6结语

目前已明确了可能导致氧化应激现象产生的原因以及氧化应激对卵母细胞和胚胎发育的不良作用。这些不良作用包括通过损害线粒体功能，影响ATP合成；干扰脂质代谢，影响脂蛋白水平；造成蛋白酶损伤，影响代谢活动。而这一系列不良作用是通过更具体的分子机制、信号转导通路，还是直接影响卵母细胞成熟、减数分裂、受精和胚胎发育，仍有待进一步证实。尽管在基因、代谢和生殖领域已开展了大量研究探讨与卵巢功能异常有关的病因学和病理学机制。但是，要阐明与卵母细胞发育潜能和IVF-ET结局相关的分子学及遗传学作用机制仍是一项巨大的挑战。今后应对卵母细胞及胚胎发育微环境中氧化应激进行更深入研究，明确拮抗氧化应激、提高胚胎质量的可行性及潜在机制，为进一步优化卵母细胞成熟培养体系提供理论依据，为加强人类辅助生殖技术的应用提供理论依据。

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［本文编辑秦娟］

Effects of Oxidative Stress on Oocyte Development and the Outcome of in vitro Fertilization-Embryo Transfer:A Review

OUYANG Xiao-e，HU Rong.Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China （OUYANG Xiao-e）；Reproductive Medicine Center，The General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China（OUYANG Xiao-e，HU Rong）

HU Rong，E-mail:hr7424@126.com

·综述·

（2016-03-18）