黄　鑫(综述)，张敏州(审校)

(广东省中医院重症医学科，广州 510120)



盲肠结扎穿孔术——脓毒症模型研究的金标准

黄鑫(综述)，张敏州※(审校)

(广东省中医院重症医学科，广州 510120)

摘要：脓毒症是一个高发病率、高病死率的疾病。其发病特点是全身炎性反应失调引起的免疫功能障碍，因此如何选择最佳动物模型对研究脓毒症至关重要。盲肠结扎穿孔术(CLP)是目前研究脓毒症应用最广泛、最具代表意义的一种模型，更类似于人类脓毒症的进展和特点。尽管CLP不能完全复制临床的脓毒症，但其仍为脓毒症发病机制和防治研究提供了大量有意义的基础数据。该文对CLP的研究应用予以综述，以促进实验研究与临床试验间的转化。

关键词：脓毒症；盲肠结扎穿孔术；免疫

脓毒症目前被定义为威胁生命的严重宿主炎性反应，并伴随有器官功能衰竭；是严重创伤、烧伤、中暑、休克、大手术后常见的并发症，也是导致重症患者死亡的主要原因之一[1]。随着社会和医疗的不断发展，脓毒症依然是一个未被攻克的临床难题。由于对脓毒症潜在的发病机制一直没有明确，为探讨脓毒症的发生过程，各种各样的动物模型应用于实验研究中，包括血管内输注活菌模型、毒素/脂多糖攻击模型、盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)和升结肠支架置入腹膜炎模型等。其中CLP是目前研究脓毒症及脓毒性休克应用最广泛的一种模型[2]，现对CLP模型特点及其研究应用进行综述。

1CLP模型介绍

CLP模型由Wichterman等[3]改良并推广应用，至今已有30多年。2009年，Rittirsch等[4]将方法步骤标准化，其CLP造模方法是：氯胺酮 (80～100 mg/kg)和甲苯噻嗪(5～15 mg /kg)腹腔注射麻醉小鼠，然后在其腹壁正中切口，轻轻拉出盲肠，避免碰伤肠系膜血管，并轻轻地挤压盲肠上端粪便，使盲肠末梢充盈，分离肠系膜表面血管；用无菌4号丝线在盲瓣与盲肠中点进行结扎，并用21 G无菌针头在结扎部位与盲肠顶端的中点处贯通穿刺盲肠壁，造成穿孔；轻轻挤压盲肠，挤出少许内容物以确保穿孔通畅，将挤出的内容物擦净，然后把盲肠推回腹腔，关闭腹腔，逐层缝合；手术后用生理盐水进行液体复苏(37 ℃，5 mL/100 g)并应用丁丙诺啡 (0.05 mg/kg)止痛。

1.1CLP模型优点与其他模型相比，CLP模型模仿临床脓毒症的特点，剖腹术引起组织创伤，远端盲肠结扎引起组织坏死，穿孔后混有细菌的肠内容物持续漏入腹腔引起感染，从而诱发腹膜炎，导致肠道细菌移位，从而激活免疫系统，最终出现呼吸、循环等系统衰竭，脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，直至死亡。由于CLP病理过程与临床症状贴近，因此被认为是进行脓毒症研究的金标准[5]。与其他脓毒症动物模型相比，CLP模型具有以下优点：①步骤简单，容易复制，适用于大或小的动物；②CLP模型无需接种物，其病原体来自于宿主本身，与临床上由外伤引发的腹膜炎相似；③病原体释放的毒素导致败血症和脓毒症症状及体征，在数天后可出现心血管系统衰竭和死亡，与临床情况贴近；④模型复制后可诱发动物机体产生大量细胞因子，其细胞因子水平改变的时机及维持时间与临床患者相似；⑤CLP模型是多种病原微生物感染引发的脓毒症模型，可引起与人类脓毒症相似的早期高动力型(高排低阻)及晚期低动力型(低排高阻)的血流动力学变化，因此其应用广泛[6]。

1.2CLP模型不足虽然CLP模型与临床发生极为贴近，但也有自身的不足，其存在的主要问题是不同研究团队采用相同实验方法建立的CLP 模型所得到的病死率存在较大差异；而此模型结果的不均一性直接影响以CLP为基础的各项研究的可靠性[5]。研究发现，影响CLP模型病死率的因素很多，如是否术前禁食、盲肠结扎的长度、穿刺针的粗细和穿孔数量、外科手术切口大小及手术时间、麻醉药的差异、是否进行了液体复苏和抗生素的应用、昼夜循环节律的影响、动物性别、年龄、品系差异以及宿主反应不同等，其中最主要的问题是CLP模型中感染细菌的量难以控制[7]。由于动物的个体差异，盲肠的大小不一，导致盲肠结扎的长度不同，结扎后的坏死区域大小不均一，从而引起感染程度的不同；Parker和Watkins[8]认为，盲肠结扎的长度越大，流入腹腔的总粪便量越多，感染越重，病死率越高；而盲肠穿刺针的粗细和穿孔数量一直以来因被认为是影响病死率的主要因素而倍受关注，不同粗细的穿刺针和穿孔数量会使流入腹腔的粪便量(细菌量)不同，这也暗示感染的严重程度不同病死率也有差异。且由于个体的差异，一定比例的CLP模型能够将感染灶局限化，因此不会发展到脓毒症[9]。尽管Rittirsch等[4]尽可能地将CLP 模型步骤标准化，但上述问题仍不能解决。因此，模型制备方法的高度一致性与可重复性至关重要，但目前并无此相关报道。

2CLP模型应用

尽管CLP模型有很多不足，但其依然是脓毒症研究，尤其是免疫系统研究中必不可少的模型之一，对脓毒症研究的不断深入起到了至关重要的作用。

2.1免疫激活期脓毒症初期是免疫激活期，出现非特异免疫系统过度活化，诱发大量炎性介质包括细胞因子和趋化因子的释放，从而进一步诱发失控性炎性反应，而如何识别病原体，建立有效的免疫屏障是关键。研究发现，固有免疫细胞中胚系编码的模式识别受体可以识别除内毒素外的病原相关分子模式，并通过Toll样受体信号介导产生各种炎性细胞因子、Ⅰ型干扰素和抗微生物蛋白[10]。文献报道，脓毒症主要的促炎因子包括白细胞介素(interleukin，IL)1、IL-2、IL-6、IL-8、高迁移率族蛋白B1、巨噬细胞游走抑制因子、一氧化氮、血小板活化因子、补体C3a和C5a、肿瘤坏死因子和单核细胞趋化因子1等，而且IL-6的高表达与CLP造模后的病死率呈正比[11]。因此，在体内阻断这些细胞因子已被视为一个新兴的治疗方案。新近发现IL-7和IL-17成为脓毒症中的关键细胞因子[12-13]，同时，抗炎因子IL-10及糖皮质激素也参与了此过程[14]，预示着脓毒症进入免疫抑制期。

2.2免疫抑制期在免疫激活的同时，机体出现免疫抑制现象，表现为抗炎因子水平显著上调和特异性免疫系统的功能障碍，导致促炎因子与细胞膜上受体结合受阻、免疫应答反应下调、T细胞反应性低下或无反应。Hotchkiss等[15]发现，淋巴细胞凋亡与免疫功能抑制密切相关，抑制淋巴细胞凋亡有助于改善机体免疫功能，进而提高生存率。新近有研究发现，IL-7可以促进T细胞的活化能力，提高T细胞受体的多样性，增加细胞黏附分子的表达，降低淋巴细胞的凋亡，从而提高动物的生存率[16-17]。

2.3凝血系统和补体系统脓毒症不仅与炎性通路相关，还会严重影响凝血系统[18]和补体系统[19]。凝血系统和补体系统对脓毒症的发病过程具有重要影响，两者与炎性反应相互促进，共同构成脓毒症发生、发展的关键因素[5]。临床发现，脓毒症患者出现活化蛋白C、抗纤维蛋白酶、组织因子等抗凝物质水平降低，导致机体凝血系统变为促凝状态[20]。CLP模型中发现，给予组织型纤溶酶原激活剂干预后，可明显改善机体凝血状态，并提高动物生存率[21]。凝血系统与炎性反应相互关联，炎性因子的大量释放诱导增加凝血酶表达、降低抗纤维蛋白酶表达、抑制抗凝血酶生成、损伤纤溶系统，影响正常凝血机制[22]。补体的3条活化途径在脓毒症中均被不可控地放大，从而导致体内活化的补体水平增高[23-24]。尤其是C5a，有很强的促炎作用，可引起胸腺细胞、肾上腺髓质细胞和心肌细胞的凋亡，因此阻断C5a成为一种潜在的治疗手段[25]。目前研究发现，C5a的2个不同受体C5aR(CD88)和C5L2(GPR77)均参与脓毒症的发病过程，并且这两者可能相互关联[25-26]。

3CLP模型与临床转化

虽然CLP模型在病理生理和免疫系统中可阐述脓毒症的发生、发展，并取得一定研究成果，但这些成果却不能很好地转化为临床应用；一些在动物实验中显示出很好疗效的药物，在临床试验性治疗中并未取得预期的结果，IL-2阻断剂、类固醇等在临床试验中相继失败，有的甚至显示出有害作用[27-28]。动物实验与临床试验出现如此强烈的差异，首先是脓毒症的发病机制一直没有明确，其次CLP模型不能充分模仿出临床脓毒症的复杂变化[29]。

3.1脓毒症致病机制的认识脓毒症的致病机制一直是大家所关注的焦点。目前得到大家普遍认可的是3个假说，即以免疫系统过度活化诱发的失控性炎性反应为特征的全身炎性反应综合征假说；以代偿性抗炎反应诱发的免疫抑制为特征的代偿性抗炎反应综合征假说和混合性拮抗反应综合征假说[30-32]；且这3个假说已被一一证实[33-34]。事实上，脓毒症中促炎与抗炎是相互交叉的过程，到底是抗炎在先还是促炎在先是研究者们一直争议的问题。Cyktor和Tumer[35]研究发现，无论是原核生物还是真核生物其病原体都能刺激细胞分泌IL-10。Muenzer等[36]观察到，CLP造模后给予2次感染打击，IL-10水平异常增高，与病死率呈正比；而IL-10抑制剂AS-101干预后，病死率显著下降。Huet和Chin-Dusting[37]新近提出一个新的概念，即初始抗炎反应综合征，机体局部或系统在炎性反应初期出现的抗炎反应；也就是说，脓毒症早期的抗炎反应被认为是对抗初始抗炎反应，从而引起暴发性炎性反应。

3.2临床脓毒症的复杂性脓毒症临床患者的预后受多方面影响，动物模型无法模拟临床脓毒症的复杂性，包括性别、年龄、体质量、营养条件、遗传学、社会因素(吸烟、饮酒、压力)、环境因素、病因、治疗时间、抗生素应用、支持治疗、抗凝、并存疾病等[5]。脓毒症的致病因素多种多样，革兰阴性和革兰阳性细菌、病毒和真菌感染等均可诱发，但CLP模型模仿的是临床穿孔性腹膜炎引发的脓毒症，为多种微生物混合的肠道细菌；临床脓毒症患者年龄大都在50岁以上，而实验大鼠的一般年龄是2～3个月，相当于人的10岁，Turnbull等[38]证实了CLP模型中年龄与病死率的相关性；同时发现，临床脓毒症的治疗时间都是在发病后，而实验室的治疗时间大都是在CLP模型前；临床脓毒症患者检测手段多种多样，而同样的检测手段在动物模型中的应用却少之又少。临床脓毒症的复杂性决定了CLP模型的局限性，于是不同的团队尝试不同的模型方法进行研究，但上述的这些局限性在其他的脓毒症动物模型中也普遍存在，因此并未获得认可的结论。

4小结

尽管脓毒症的多种动物模型存在诸多局限(包括CLP模型无法完全再现人类脓毒症的演变过程)，但CLP依然是目前最具代表意义的脓毒症模型，故仍被认为是脓毒症的金标准模型。为了改善脓毒症的治疗前景，研究者必须进一步深入探索脓毒症的免疫与发病机制，思考如何合理改进动物模型，尽最大可能地模拟临床脓毒症的复杂性，以增强模型与临床的符合性，确定新的治疗靶点，寻求更好的脓毒症防治思路和策略。

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Gold Standard for the Model Research of Cecal Ligation and Puncture-Sepsis

HUANGXin,ZHANGMin-zhou.

(IntensiveCareUnit,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China)

Abstract:Sepsis is a disease of high incidence and high mortality,which is characterized by dysregulated systemic inflammatory responses followed by immunosuppression,so how to choose the best animal model for the study of sepsis is crucial.Sepsis induced by cecal ligation and puncture(CLP) is the most widely used model.Although CLP does not completely reproduce the complexity of human sepsis,the CLP model is one of the best representations of human sepsis which has made important contributions to our knowledge of the inflammation involved in sepsis and to the identification of therapeutic strategies.Here we gathered these data on the CLP-induced sepsis model for a review to narrow the gap between experimental research and clinical trial.

Key words:Sepsis; Cecal ligation and puncture; Immunity

基金项目：广东省科技厅项目(20110315)；广州中医药大学创新基金(11CX073)；广东省中医药局(20121170)；广东省卫生厅(s2012010010397)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.03.004

中图分类号：R631

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)03-0392-04

收稿日期:2014-04-08修回日期:2014-07-21编辑:伊姗