任雪峰，吴冬青，林 敏，宋 海，温 娜，安红钢，*

（1.河西学院化学化工学院，甘肃张掖734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖734000）

响应面法优化款冬花总鞣质提取工艺的研究

任雪峰1，2，吴冬青1，2，林 敏1，2，宋 海1，2，温 娜1，安红钢1，2，*

（1.河西学院化学化工学院，甘肃张掖734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖734000）

目的：优选款冬花总鞣质的提取工艺。方法：采用响应曲面法优选款冬花中鞣质的最佳条件，以提取率为指标，采用EDTA络合滴定法测定提取率。结果：款冬花总鞣质提取的最佳工艺为：丙酮浓度为31%，提取温度30℃，料液比1∶12，提取时间167min。在此条件下，款冬花总鞣质的提取率可达14.97%，RSD（n=5）为0.63%，与预测值15.26%十分接近。结论：该工艺提取冬花中总鞣质是可行的。

款冬花，鞣质，响应曲面设计，EDTA

Abstract：EDTA complexing titration was used and extraction ratio was taken as the index with the method of Flos Farfarae to analyze the optimum extraction conditions，the influence factor were also investigated and identified as acetone concentration 31%，solid to liquid ratio 1∶12，extraction temperature 30℃ and extraction time 167min.The results showed that under the optimum extraction conditions the experimental value was 14.97%（RSD（n=5）），which was similar to the predicted value of extraction rate of tannins（15.26%），and the method was work fine.

Key words：Flos Farfarae；tannins；response surface methodology（RSM）；EDTA

款冬花（Flos Farfarae）为菊科（Compositae）植物款冬（Tussilago farfara.L）的干燥花蕾[1]，主产于甘肃、河南、陕西、山西等地，性温，味辛，微苦，归脾经，具有润肺下气，止咳化痰之功效[2]。近代医学研究表明，款冬花有明显的支气管解痉、中枢兴奋、呼吸兴奋和抗炎等作用[3]。其主要化学成分为芦丁、槲皮素、款冬酮、款冬二醇等[4]。鞣质是一类具有沉淀蛋白质特性水溶性多酚类化合物[5]，广泛存在于植物界。约70%以上的中草药中含鞣质类化合物，鞣质在过去常作为杂质除去，近代毒理学和药理学研究表明，鞣质具有明显体外抑菌、抗脂质氧化、止痛止血、抗肿瘤、抗癌变等功效[6]，引起了国内外广泛关注[7-12]。目前，鞣质的提取方法主要有超声提取法[13]、回流提取[14]、浸提法[15]。实验运用响应面设计方案，采取EDTA滴定法，以款冬花提取液中总鞣质含量为指标，考察影响鞣质提取的因素，优化了各种提取工艺的条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

款冬花 采自甘肃省陇西市，将款冬花先经自来水、蒸馏水洗净，置于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过60目筛，备用；EDTA、丙酮、乙酸锌、氨-氯化铵缓冲溶液（pH10.0）、浓氨水、铬黑T等试剂 均为分析纯；实验用水 为三次水；所用仪器均经自来水、三次水清洗备用。

GB204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司；800型离心沉淀器 上海手术器械十厂；YLD-2100电热恒温鼓风干燥箱上海琅玕实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鞣质提取工艺流程 款冬花→洗净→晾干→粉碎→烘干至恒重→加入一定量丙酮水溶液→回流提取→抽滤→滤液→定容→得鞣质待测液

1.2.2 鞣质的测定原理 利用Zn2+只与鞣质反应的特性，用Zn2+沉淀分析溶液中的鞣质，剩余Zn2+以铬黑T作指示剂，以EDTA·2Na溶液滴定。

1.2.3 络合法测定鞣质提取率[16]量取50.00mL提取液于250mL锥形瓶中，加水约至150mL，置（35±2）℃水浴中预热5min。精确量取10.00mL 1mol/L醋酸锌溶液于上述锥形瓶中，再加入7mL氨水，摇匀使白色沉淀溶解，反应30min间歇搅拌数次，待反应完毕，冷却至室温，定容至250mL容量瓶中，抽滤。移取上述溶液20.00mL于250mL锥形瓶中，加50mL水、12.5mL氯化铵-氨水缓冲液（pH10.0）和三滴铬黑T，以0.02mol/L EDTA滴定至溶液由酒红色变成暗绿色。总鞣质提取率按下式计算：

总鞣质提取率（%）=（10×CZn-12.5×CEDTA×V）×0.1556/G×100

式中：0.1556—实验常数；CZn—醋酸锌标准溶液浓度（mol/L）；CEDTA—EDTA·2Na标准溶液浓度（mol/L）；V—校正后的EDTA·2Na标准溶液滴定消耗量（mL）；G—款冬花样品质量（g）。

1.2.4 响应面优化实验[17-18]在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，进一步进行4因素3水平的响应面分析实验，选择丙酮浓度、料液比、提取温度及提取时间为自变量，款冬花总鞣质提取率为响应值，确定各因素对款冬花总鞣质含量影响的显著性和各提取条件的最佳组合，其水平编码表见表1。

表1 响应面法实验的因素水平编码Table 1 Factors and levels of RSM

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 丙酮浓度对提取效果的影响 称取一定量款冬花，固定提取时间为2h，提取温度为30℃，料液比为1∶20，以丙酮浓度为单因素进行实验，丙酮浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%。回流两次，合并滤液，定容在250mL的容量瓶中，按1.2.3测定鞣质提取率。由图1可以看出，随着丙酮浓度的升高，款冬花提取率不断提高，丙酮浓度继续升高则鞣质的提取率呈现下降趋势，主要是因为鞣质为多羟基化合物，具有较强极性，丙酮浓度升高导致溶剂极性下降，致使提取率呈下降趋势。因此选择丙酮浓度为30%。

图1 丙酮浓度对鞣质提取率的影响Fig.1 Effect of acteone concentration on extraction rate of tannins

2.1.2 提取温度对提取效果的影响 称取一定量款冬花，固定丙酮浓度为30%，提取时间为2h，料液比为1∶20，以提取温度为单因素进行实验，提取温度分别为10、20、30、40、50℃，回流两次，合并滤液，在250mL的容量瓶中定容，按1.2.3测定鞣质提取率。由图2可以看出，当提取温度为30℃时，款冬花鞣质的提取率最高，继续提取则鞣质的提取率呈现下降趋势，这可能是由于提取温度稍高，导致鞣质被氧化而造成的，因此选择提取温度为30℃。

图2 提取温度对鞣质提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of tannins

2.1.3 料液比对提取效果的影响 称取一定量款冬花，固定提取时间为2h，提取温度为30℃，丙酮浓度为30%，以料液比为单因素进行实验，料液比分别为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，回流两次，合并滤液，在250mL的容量瓶中定容，按1.2.3测定鞣质提取率。由图3可以看出，料液比为1∶10时提取效果最佳。分析原因可能是液料比太小，溶剂不足以溶解足够多的鞣质，而当固液比增加到一定程度时，原料内部与溶剂之间溶质已经达到平衡，反而使杂质溶解增加，相应减少鞣质的提取率。

图3 料液比对鞣质提取率的影响Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on extraction rate of tannins

2.1.4 提取时间对提取效果的影响 称取一定量款冬花，固定丙酮浓度为30%，提取温度为30℃，料液比为1∶10，以提取时间为单因素进行实验，提取时间分别为60、90、120、150、180、210min，回流两次，合并滤液，定容在250mL的容量瓶中，按1.2.3测定鞣质提取率。由图4可以看出，提取时间为180min时提取效果最佳。这可能是回流时间太长，有部分丙酮被挥发而导致沸点逐渐增大，从而破坏某些鞣质所导致。

2.2 款冬花总鞣质提取方法的响应面优化

按照Box-Behnken中心组合实验方案进行了四因素三水平实验，以鞣质提取率为指标，研究各因素间相互作用下的提取率值，实验结果见表2。

图4 提取时间对鞣质提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of tannins

表2 响应面设计方案及实验结果Table 2 Experimental design of RSM and results

表2中6～29为析因实验，1～5为中心实验。29个实验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用来估计实验误差[19]。

2.3 响应面分析与优化

采用Design-expert 7.1.6软件对表2中数据进行多项式拟合回归，建立多元二次响应面回归模型：

Y=14.47-0.054X1+1.07X2+0.30X3-0.97X4-0.43X1X2+0.37X1X3+0.043X1X4-0.25X2X3+1.78X2X4-0.15X3X4-2.02X12-4.31X22+0.25X32-1.26X42

因素的ANOVA分析结果见表3。

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression

由表3可看出，模型的“Prob＞F”值小于0.0001，表明二次方程拟合极显著，失拟项F值大于0.05，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的。决定系数为R2=0.9805，校正系数为R2=0.9601。也说明回归方程的拟合程度很好，失拟较小。变异系数CV值越低，显示实验稳定性越好[14]。从表3中的p值可知，方程中X2、X4、X2X4、X12、X22、X42对Y值的影响极其显著（p＜0.01），这与模拟回归预测吻合。综上所述，该回归方程为优化款冬花鞣质的提取工艺条件提供了一个良好的模型，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

图5 各参数的响应曲面图Fig.5 Response surface indicating the effects of acteone concentration，extraction temperature，solid to liquid ratio and extraction time and their pairwise interactions on tannins yield

图5是根据回归方程所绘制的响应面图，他们能直观地描述两个因素之间对响应值的交互作用。从图5中可以看出，提取温度和提取时间交互作用显著，表现为曲线比较陡峭。四个因素对于款冬花总鞣质提取率的影响顺序为：X2＞X4＞X3＞X1，即提取温度影响最大，提取时间次之，料液比再次之，最后为丙酮浓度影响。

2.4 验证实验

根据所得的回归模型，由Design Expert 7.1.6软件对实验参数进一步优化，可以得出最优条件为：丙酮浓度为30.71%，提取温度30.01℃，料液比1∶12，提取时间166.81min，在此条件下，款冬花总鞣质提取率理论上可达15.28%。考虑到实际操作的可行性，将最佳条件在回归方程得到的理论值基础上修正为：丙酮浓度31%，提取温度30℃，提取时间167min，料液比为1∶12，款冬花总鞣质提取率修正为15.26%。在此条件下进行五次平行实验，实际测得的款冬花总鞣质提取率为14.97%，与修正条件后理论值相差1.90%，且五次提取的RSD=0.63%，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实际价值。

3 结论

3.1 在单因素实验的基础上，应用响应面法优化款冬花总鞣质的提取工艺。结果表明：提取温度、提取时间、丙酮浓度二次方项、提取温度二次方项、提取时间二次方项及提取温度和提取时间交互作用对款冬花总鞣质提取率的影响极显著（p＜0.01），说明丙酮浓度、提取温度、料液比和提取时间在款冬花总鞣质的提取率影响中不是简单的线性关系，而是存在交互作用。

3.2 回归分析及验证实验结果表明，该方法准确、可行。款冬花总鞣质提取的最佳条件为：丙酮浓度为31%，提取温度30℃，料液比1∶12，提取时间167min。在此条件下，款冬花总鞣质的提取率可达14.97%，RSD（n=5）为0.63%。

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Optimization of extraction technique of tannins from Flos Farfarae by response surface methodology

REN Xue-feng1，2，WU Dong-qing1，2，LIN Min1，2，SONG Hai1，2，WEN Na1，AN Hong-gang1，2，*
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Hexi University，Zhangye 734000，China；2.Key Laboratory Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Provinical University，Zhangye 734000，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）16-0292-04

2011－12－23 *通讯联系人

任雪峰（1976-），男，副教授，研究方向：天然产物有效成分提取与分离纯化。

甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室（XZ-1008）；河西学院青年基金（201031）资助项目；河西学院青年骨干教师资助项目。