葛珍珍，王 杰，周灿灿，余晓斌

（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

响应面法优化小球藻培养基

葛珍珍，王 杰，周灿灿，余晓斌*

（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

为了提高小球藻的生物量，对BG11培养基的成分进行了响应面优化。通过单因素实验筛选出了适合小球藻生长的最佳碳源、氮源分别为葡萄糖和尿素，并发现适量添加海绿素可显著促进小球藻的生长。利用Minitab软件设计Plackett-Burman实验筛选出了影响小球藻生长的三个最重要因子；通过Box-Behnken实验及响应面分析确定了三个因子的最佳浓度：磷酸氢二钾58mg/L，硫酸镁162mg/L，海绿素198μL/L。用优化后的培养基培养小球藻，48h后的藻细胞干重达10.09g/L，比优化前提高了61.2%，油脂及蛋白质产量分别达3.62和3.81g/L。

小球藻，响应面，培养基优化，海绿素

Abstract：In order to improve the biomass yield of Chlorella vulgaris，optimization of BG11 medium was carried out by response surface analysis.The optimal carbon and nitrogen sources for C.vulgaris were glucose and urea，respectively.An appropriate amount of seaweed liquid fertilizer could significantly promote the growth of C.vulgaris.Three most important substrates for C.vulgaris were screened via Plackett-Burman experiments using Minitab software.Optimal concentrations of the three substrates were confirmed by Box-Behnken design and response surface analysis.The results were 58mg/L of dipotassium hydrogen phosphate，162mg/L of magnesium sulfate and 198μL/L of seaweed liquid fertilizer.Cultivated with the optimized medium，dry cell weight of C.vulgaris after 48h reached 10.09g/L，increased by 61.2%compared with the original medium.The lipids yield was 3.62g/L，and the protein yield was 3.81g/L.

Key words：Chlorella vulgaris；response surface analysis；culture medium optimization；seaweed liquid fertilizer

小球藻含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质元素、多不饱和脂肪酸等重要的营养物质，被FAO列为21世纪绿色健康食品[1]。1890年荷兰微生物学家首次获取了小球藻的纯培养物；1950年，小球藻作为优质营养品在日本率先被引入市场[2]。小球藻细胞内含有多种活性成分如多糖、色素、小球藻生长因子（CGF）等[3]，由小球藻加工制成的多种食品[4]、饲料[5-6]、保健品等[7-8]已经得以研发生产，对小球藻的研究也逐渐成为国内外研究的前沿和焦点。小球藻可以进行自养生长，也可以利用一些有机碳源进行异养生长[9]。与自养相比，异养培养能大幅度提高小球藻的生长速率，为工业化生产提供可能[10]。培养基的成分是影响小球藻生长速率的主要因素，对培养基的优化是提高小球藻产量的有效途径。响应面分析法通过合理设计实验并对数据进行统计分析，建立二次响应面回归模型，进而寻求最优响应因子水平及响应值[11]。海绿素（seaweed liquid fertilizer）是一种天然海藻提取物，由英国欧麦思农用流体公司研发，因含有生长素、细胞分裂素等多种天然植物激素及维生素、低聚糖等活性因子，海绿素已在农业领域得到应用[12]，但其对藻类影响的研究尚未见报道，本文考察了碳源、氮源及海绿素对小球藻生长的影响，并对培养基的成分进行了响应面优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普通小球藻（Chlorella vulgaris） 本实验室保藏藻种，编号CV03；基础培养基 BG11[13]；海绿素 北京新禾丰农化有限公司；葡萄糖等 国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

GXZ光照培养箱 宁波艾德电子有限公司；HYLB全温摇瓶柜 太仓市强乐实验设备有限公司；UV-2800AH紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；VELP UDK152全自动凯氏定氮仪 北京盈盛恒泰科技有限责任公司。

1.2 培养基的优化方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 碳源、氮源实验 碳源：以BG11为基础，分别添加相同碳质量浓度（4.8g/L）的葡萄糖、果糖、蔗糖和醋酸钠培养小球藻，对照组不添加有机碳源进行光照培养，光照强度4000lux，光暗周期比为14L/10D，接种后48h取样测细胞干重。

氮源：分别用相同氮质量浓度（0.25g/L）的硝酸钠、氯化铵、尿素和甘氨酸作为氮源，对照组不添加氮源，接种后48h取样测细胞干重。

1.2.1.2 海绿素实验 向BG11培养基中分别加入不同浓度的海绿素，接种后48h取样测藻细胞干重，观察海绿素对小球藻生长的影响。

1.2.2 Plackett-Burman（PB）实验 Plackett-Burman设计法，是两水平部分因子实验，适合从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，以便进一步详细研究[14]。根据前面的单因素实验结果设计PB实验，实验次数N=12，响应值为培养48h后小球藻的细胞干重。

1.2.3 最陡爬坡实验 响应面拟合方程只有在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域里拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义[15]。最陡爬坡实验以因子水平变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因子的效应来确定步长，能快速、准确地逼近最佳值区域[16]。对PB实验所筛选出的重要因子进行最陡爬坡实验来确定各因素的水平。

1.2.4 响应面分析 响应面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，其中常用的是Box-Behnken的中心组合设计原理[17]。根据PB实验及最陡爬坡实验结果，设计Box-Behnken实验并对其结果进行响应面分析。

1.2.5 测定方法

1.2.5.1 细胞干重的测定 通过拟合藻细胞干重与藻液吸光值之间的线性关系来测定[18]：取对数期藻液，经紫外可见分光光度计扫描300～800nm，结果显示小球藻在680nm处有最大吸收峰值。取一定量藻液，经不同比例稀释，测定各稀释度对应的细胞干重和吸光值，得到线性回归方程：

细胞干重（g/L）=0.422×OD680-0.0026，R2=0.9971

1.2.5.2 油脂含量的测定 乙醚-石油醚法[19]。

1.2.5.3 蛋白质含量的测定 凯氏定氮法[20]。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源、氮源对小球藻生长的影响

碳源、氮源实验结果见表1。

表1 不同碳源、氮源对小球藻生长的影响Table 1 Effect of different carbon and nitrogen sources on the growth of C.vulgaris

结果表明，葡萄糖为小球藻的最佳碳源，48h后的细胞干重比对照组提高了5倍，其次是蔗糖，而以醋酸钠和果糖为碳源组，细胞干重仅比对照组略微增加。

没有添加氮源的对照组小球藻生长最为缓慢，以尿素作为氮源培养小球藻生长最快，其次是硝酸钠和甘氨酸，而以氯化铵作为氮源，观察到藻液变黄，小球藻长势较差。

2.2 海绿素对小球藻生长的影响

国内外在海绿素对植物生长的影响方面做了大量研究，例如Thirumaran等[21]研究发现，20%的海绿素会促进秋葵（Abelmoschus esculentus）的生长；陈卫民等[22]指出，适量喷施海绿素可以改善全球红葡萄的果实品质；据报道海绿素对棉花、玉米的生长发育也有促进作用[23-24]。藻类与植物在一些生理特性上存在相似性，因此考虑海绿素可能也会对藻类的生长繁殖起到促进作用。海绿素对小球藻生长的影响实验结果见图1。

图1 海绿素对小球藻生长的影响Fig.1 Effect of seaweed liquid fertilizer on the growth of C.vulgaris

由图1可知，当海绿素浓度低于500μL/L时，能够促进小球藻的生长；在100μL/L时效果最佳，藻细胞干重（6.200g/L）相比对照组（4.380g/L）提高了41.55%；当海绿素的添加量分别为1000和2000μL/L时，藻细胞干重分别为3.754和2.943g/L，均比对照组低。这表明，适量的海绿素会促进小球藻的生长，而当海绿素添加量大于1000μL/L时，对小球藻的生长无促进作用，相反会抑制小球藻的生长。其原因可能是低浓度的海绿素为小球藻的生长提供了丰富的生长因子，海绿素中的细胞分裂素成分能够促进小球藻细胞的分裂增殖，从而使小球藻的细胞密度增大；但随着海绿素浓度的增大，培养基中高浓度的细胞分裂素会对藻细胞产生毒害作用，从而抑制了藻细胞的生长。本实验首次发现了海绿素对藻类生长的促进效应，可为海绿素在藻类培养中的应用提供一定的理论依据。

2.3 Plackett-Burman（PB）实验设计及结果

PB实验选取葡萄糖等影响小球藻生物量的7个因素进行考察，每个因素分高、低两个水平，其中高水平为低水平的1.5倍，PB实验设计及结果见表2。

由表2可以看出，影响小球藻细胞干重的重要因子（置信度＞90%）包括海绿素、硫酸镁和磷酸氢二钾，且均为正效应（T值＞0），其中海绿素的主效应极显著（p=0.004），而其他因素的影响不显著。利用Minitab软件绘出各因子标准化效应的Pareto图（图2），响应值为培养48h后小球藻的细胞干重，α=0.05，Minitab在Pareto图中显示效应的绝对值，由Pareto图可以更为直观地发现海绿素、硫酸镁、磷酸氢二钾具有显著性（t＞参考值2.132）。因此将海绿素、硫酸镁、磷酸氢二钾3个培养基组分作为主要因子进行下一步的分析研究。

表2 PB实验设计及结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

图2 标准化效应的Pareto图Fig.2 Pareto chart of standardized effect

2.4 最陡爬坡实验设计及结果

由PB实验结果可知，对小球藻细胞干重有显著影响的海绿素、硫酸镁、磷酸氢二钾皆为正效应，因此其浓度水平应增加，根据三个因素的效应值大小设计它们的变化方向及步长进行最陡爬坡实验，实验设计及结果见表3。

表3 最陡爬坡实验设计及结果Table 3 Design and results of steepest ascent test

从表3可以看出，最佳水平条件出现在实验组2与实验组3之间，确定以实验组3的条件为响应面实验的中心点。

2.5 Box-Behnken实验结果分析

根据PB及最陡爬坡实验结果确定Box-Behnken实验的三个因素及其水平，具体见表4。

Box-Behnken实验设计及结果见表5。以小球藻的细胞干重为响应值，利用Minitab软件对Box-Behnken的实验结果进行回归分析及回归拟合[25]（表6），得到响应值Y与因子X之间的回归方程：Y=10.0283+0.0237X1+0.1635X2-0.1029X3-0.4315X12-0.2469X22-0.3576X32-0.1424X1X2+0.1583X1X3+0.1319X2X3

由表6中的回归分析结果可知，模拟方程中的常量项p值为0，表明此模型显著。其中X2、X12、X22、X32和X1X3对小球藻的细胞干重都有显著的影响（p＜0.05），决定系数R2为0.9595，表明此回归方程拟合得很好[26]。回归方程的方差分析结果见表7，可知回归、线性、平方及交互作用的效应都较显著（p值分别为0.006、0.033、0.002和0.047），失拟检测p值为0.300（＞0.05），表明失拟不显著，回归模型适合[27]。

表4 Box-Behnken实验的因素与水平设计Table 4 Factors and levels of Box-Behnken design

表5 Box-Behnken实验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 回归方程的系数估计值Table 6 Estimation value of regression coefficient in regression equation

表7 回归方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.6 响应面最优值的获取及验证

利用Minitab软件绘制出上述回归方程的响应面立体图，见图3～图5。

图3 Y=f（X1、X2）响应面立体分析图Fig.3Response surface plot of the function Y=f（X1、X2）

图4 Y=f（X1、X3）响应面立体分析图Fig.4Response surface plot of the function Y=f（X1、X3）

图5 Y=f（X2、X3）响应面立体分析图Fig.5Response surface plot of the function Y=f（X2、X3）

对回归方程取一阶偏导等于零得三元一次方程组，利用Matlab软件求解[28]，得极值点坐标X1=-0.0424，X2=0.3181，X3=-0.0946，相应因子及对应值分别为：海绿素198μL/L、硫酸镁162mg/L、磷酸氢二钾58mg/L，并预测响应值（48h后小球藻的细胞干重）为10.06g/L。以优化前的培养基为对照，用此模型条件培养小球藻，48h后的藻细胞干重为10.09g/L（与预测值差0.3%），比对照组（6.26g/L）提高了61.2%；油脂含量为3.62g/L，占细胞干重的35.88%；蛋白质含量为3.81g/L，占细胞干重的37.76%。

3 结论

本文通过单因子实验发现，小球藻的最佳碳、氮源为葡萄糖和尿素；适当浓度的海绿素对小球藻的生长具有显著促进作用，当海绿素的浓度为100μL/L时，效果最佳，藻细胞干重相比对照提高了41.55%；而当浓度大于1000μL/L时，对小球藻的生长则产生抑制作用。

利用Minitab软件设计实验对BG11培养基进行了响应面优化分析，优化后的BG11培养基配方为：K2HPO458mg/L，MgSO4·7H2O 162mg/L，海绿素198μL/L；其他成分的浓度为：葡萄糖12g/L，尿素0.53g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，EDTANa20.001g/L，A5微量元素液1mL/L；利用此优化后的培养基培养小球藻，48h后的藻细胞干重达10.09g/L，比优化前提高了61.2%。

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Optimization of medium for Chlorella vulgaris by response surface analysis

GE Zhen-zhen，WANG Jie，ZHOU Can-can，YU Xiao-bin*
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0195-05

2012-01-04 *通讯联系人

葛珍珍（1988-），女，硕士，研究方向：微生物学。