廖青玲，王俊杰，李武全，艾杰妮，王锦玲

(1.解放军总医院神经内科三病区，北京100853;2.第二军医大学附属长海医院全军烧伤研究所，上海200433;3.昆明医学院 第二附属医院云南省烧伤研究所，云南昆明650101)

依达拉奉对氧剥夺引起的大鼠肠隐窝上皮细胞损伤的保护效应研究

廖青玲1，王俊杰2，李武全3，艾杰妮1，王锦玲1

(1.解放军总医院神经内科三病区，北京100853;2.第二军医大学附属长海医院全军烧伤研究所，上海200433;3.昆明医学院 第二附属医院云南省烧伤研究所，云南昆明650101)

［目的］研究依达拉奉对氧剥夺导致的IEC-6细胞株损伤的保护效应。［方法］将预先培养好的细胞分为3组:正常组(N组)，氧剥夺组(OGD，IR组)和依达拉奉治疗组(OGD+依达拉奉，E组)。本研究中所用氧剥夺模型是将细胞株换无糖无血清的培养基后放入含5%CO2和95%N2的密闭培养箱中2 h，后重新复氧复糖。在复氧复糖的同时，将依达拉奉盐溶液(10 mg/mL)加入细胞培养基中。在复氧复糖2 h，收集细胞用DHE荧光探针进行氧自由基(ROS)测定;伤后12 h，富集细胞用于超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定;伤后24 h收集细胞，用流式细胞仪测定细胞凋亡和Alamar Blue测定细胞活力。［结果］DHE荧光探针结果显示OGD导致的ROS，E组比IR组减少;OGD刺激后，IEC-6细胞内的MDA浓度上升为(1.52±0.21)mmol/mg，而E组的含量为(1.21±0.16)mmol/mg，P＜0.05。OGD后，IEC-6细胞内的SOD活力下降至(7.35±0.84)U/mg，而E组的SOD活力为(8.25± 1.12)U/mg，P＜0.05。OGD后细胞活力下降为0.48±0.081，而E组的细胞活力为0.56±0.049，P＜0.01。同时，流式细胞仪的结果显示，依达拉奉抑制了OGD导致的细胞过度凋亡。［结论］依达拉奉可以减轻OGD造成的IEC-6细胞的损伤。

依达拉奉;氧剥夺;肠隐窝上皮细胞;凋亡

机体组织器官正常代谢、功能的维持，有赖于良好的血液循环。各种原因造成的局部组织器官的缺血，常常使组织细胞发生缺血性损伤，恢复血液再灌注后，细胞功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反而加重，因而将这种血液再灌注后缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury)［1-2］。烧、创伤患者常因失血发生缺血再灌注损伤。脑部、心脏、肾脏和胃肠都是较易受到缺血再灌注损伤的器官。肠上皮细胞在肠黏膜损伤修复中起着重要的作用。大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)具有正常的未分化的肠上皮隐窝细胞的特征，因而广泛用于肠上皮细胞损伤的相关研究［3］。依达拉奉是一种新型的抗氧化剂，目前发现它对多种器官缺血再灌注损伤都有良好的治疗效果。本研究用体外氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD)建立IEC-6细胞缺血缺氧损伤模型，模拟体内肠缺血过程，进而研究依达拉奉对其损伤的保护效应。

1 材料和方法

1.1 细胞株及试剂

IEC-6细胞株购自美国 ATCC细胞库，用含10%的胎牛血清(美国Invitrogen)DMEM高糖培养基(美国Invitrogen)，24 h换液1次。

依达拉奉购自美国Sigma公司，用DMSO(美国Sigma)溶解至5 mg/mL。活性氧荧光探针购自北京威格拉斯生物技术有限公司。细胞凋亡试剂盒购自南京碧云天生物技术研究所。细胞活力测定试剂盒购自美国Invitrogen公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)购自南京建成生物工程研究所。

1.2 体外氧糖剥夺(OGD)模型建立

将IEC-6细胞预先铺被在12和96孔板，先将细胞采用无糖无血清培养液，置于含CO2∶N2(5∶95)的37℃恒温密闭容器内120 min，后换为含10%血清的正常培养液，放至正常CO2培养箱中继续培养，模拟体内缺血再灌注过程［1］。

1.3 实验分组

将预先培养好的细胞分为3组:正常组(无OGD，N组)，氧剥夺组(OGD，IR组)和依达拉奉治疗组(OGD+依达拉奉，E组)。在E组，依达拉奉(10 mg/mL)在 OGD后立即加入细胞培养基中。OGD后2 h收集细胞用于活性氧(ROS)测定，伤后12 h，富集细胞用于超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定，伤后24 h收集细胞用于细胞凋亡和细胞活力检测。

1.4 ROS测定

ROS荧光探针-二氢乙啶(Dihydroethidium，DHE)，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶;氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。本实验将DHE加入到铺被好12孔板中，使DHE的终浓度为10 μmol/L，37℃避光孵育20 min，然后用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，后用Leica DMI 3000荧光显微镜观测红色荧光的亮度。

1.5 细胞内SOD和MDA的测定

IEC-6细胞收集后，超声裂解，离心取上清液后，按照商用试剂盒的使用说明书进行 SOD和MDA的检测。

1.6 细胞凋亡测定

凋亡试剂盒中含有Annexin-V(AV)和碘化丙啶(PI)染色液，按照试剂盒说明书染色后，用流式细胞仪检测。正常的IEC-6活细胞不被AV和PI染色;凋亡早期的IEC-6细胞仅被AV染色;凋亡晚期和坏死的IEC-6细胞同时被AV和PI所染色。

1.7 细胞活力的测定

在预先铺被好IEC-6细胞的96孔板中加入AlamarBlue工作液(1∶10)，混匀后将96孔板放入37℃温箱里抚育4 h后用Bio-TekExl 800微孔酶标测定仪(美国Thermo)在570 nm处测定(630 nm作为参考波长)。细胞活力值用吸光度(A)值表示，A值跟细胞的活力成正比。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(x ±s)的形式表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，将P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 依达拉奉对OGD后IEC-6细胞株内ROS的影响

本研究中，ROS荧光探针-DHE的红色荧光强度显示，IR组IEC-6细胞内有大量的ROS产生，而E组IEC-6细胞内的ROS明显减少。见图1。

2.2 依达拉奉对OGD后IEC-6细胞株内SOD活力和MDA含量的影响

IR组IEC-6细胞内脂质氧化产物MDA的含量增加，而 E组 MDA浓度比 IR组显著降低(P＜0.05);IR组IEC-6细胞内抗氧化酶SOD的活力下降，而 E组 SOD的活力比IR组明显升高(P＜0.05)。见表1。

图1 依达拉奉对OGD后IEC-6细胞株内ROS产生的影响Fig 1 Effects of edaravone on OGD-induced ROS production

表1 依达拉奉对OGD后IEC-6细胞株内SOD活力和MDA含量的影响Tab 1 Effects of edaravone on OGD-induced change in SOD activity and MDA concentration

2.3 依达拉奉对OGD后IEC-6细胞凋亡的影响

IR组IEC-6细胞的凋亡明显高于N组和E组。见图2。

2.4 依达拉奉对OGD后IEC-6细胞活力的影响

正常状态下 IEC-6细胞的活力值为 0.69± 0.061，OGD细胞活力降低，但E组的0.56±0.049比IR组的0.48±0.081明显升高(P＜0.01)。

图2 依达拉奉对OGD后IEC-6细胞凋亡的影响Fig 2 Effects of Edaravone on OGD-induced cell apoptosis at 24 h post-injury

3 讨论

肠缺血时液体通过毛细血管滤出而形成间质水肿。再灌注后，肠道毛细血管通透性更加升高，严重肠缺血-再灌注损伤的特征为肠黏膜损伤。这可导致肠道的吸收功能障碍及黏膜的通透性升高，肠道内大量细菌和内毒素侵入体循环及组织中，造成肠源性内毒素血症［1-2］。肠上皮细胞是肠道屏障的重要组成部分，是宿主与病原微生物双向联系的第一道防御。而缺血再灌注损伤过程中，常导致上皮细胞的凋亡，IEC-6具有正常未分化肠上皮隐窝细胞的特征，本研究用体外氧糖剥夺(OGD)建立IEC-6细胞缺血缺氧损伤模型，模拟体内肠缺血过程。

依达拉奉是一种新型的抗氧化剂，目前临床上主要应用于脑中风后的患者。它的主要药理机制是可以中和·OH和ONOO-等［2-3］。目前研究发现，依达拉奉对于脑、肺、心脏、神经和肾缺血再灌注损伤都有良好的治疗效果［4-7］。本实验在建立了OGD引起的细胞损伤模型后，研究依达拉奉对其的治疗效果。

缺血再灌注损伤的发生机制跟自由基大量产生有关，而自由基产生跟黄嘌呤氧化酶形成增多，中性粒细胞的呼吸爆发，线粒体功能受损和儿茶酚胺自身氧化增加有关［4，7］。自由基对细胞的损伤作用主要是通过对膜磷脂、蛋白质酶类和核酸的破坏作用实现的。本研究发现，OGD导致了大量的ROS产生。同时ROS的大量产生可以导致膜磷脂的损伤进而导致细胞内MDA的积累。SOD是体内的重要抗氧化剂，它可以通过氧化自身来清除体内遭受损伤时过度产生的自由基，OGD过程中导致SOD的大量消耗。本研究发现，依达拉奉减轻了ROS的过度产生，细胞内MDA的蓄积和SOD活力下降。

OGD导致大量的自由基的积累不但会导致膜磷脂、蛋白质和核酸的破坏过程当中，进而引起细胞的凋亡。目前的研究表明细胞凋亡是缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式［8］。本研究发现，OGD导致细胞过度凋亡和细胞活力的降低，而外源性的依达拉奉的摄入可以减轻这样的损伤。

［1］Sasano N，Enomoto A，Hosoi Y，et al.Free radical scavenger edaravone suppresses x-ray-induced apoptosis through p53 inhibition in MOLT-4 cells［J］.J Radiat Res (Tokyo)，2007，48(6):495-503.

［2］Li Y，Xia AZ，Xing SH.Protective effect of edaravone against renal ischemia/reperfusion injury and compared with ischemic post conditioning in rats［J］.Yao Xue Xue Bao，2010，45(7):840-848.

［3］魏爱宣，李昕华，闰世军，等.大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立［J］.中国老年学杂志，2010，30(3):340-342.

［4］Zhang P，Li W，Li L，et al.Treatment with edaravone attenuates ischemic brain injury and inhibits neurogenesis in the subventricular zone of adult rats after focal cerebral ischemia and reperfusion injury［J］.Neuroscience，2011，201:297-306.

［5］Ishii J，Natsume A，Wakabayashi T，et al.The free-radical scavenger edaravone restores the differentiation of human neural precursor cells after radiation-induced oxidative stress［J］.Neurosci Lett，2007，423(3):225-230.

［6］Iida H，Nagasaka T，Shindo K，et al.Effect of the free radical scavenger edaravone on peripheral nerve ischemiareperfusion injury［J］.Muscle Nerve，2009，40(4):582-588.

［7］Yamazaki K，Miwa S，Toyokuni S，et al.Effect of edaravone，a novel free radical scavenger，supplemented to cardioplegia on myocardial function after cardioplegic arrest: in vitro study of isolated rat heart［J］.Heart Vessels，2009，24(3):228-235.

［8］Cai J，Kang Z，Liu WW，et al.Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model［J］.Neurosci Lett，2008，441(7):167-172.

Therapeutic efficacy of Edaravone on oxygen/glucose deprivation induced rat intestinal epithelial cells damage in vitro

LIAO Qing-ling1，WANG Jun-jie2，LI Wu-quan3，AI Jie-ni1，WANG Jin-ling1
(1.Department of Neurology，South Building，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China;2.Burn Center，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China;3.Burn Center of Yunnan Province，Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650101，China)

［Objective］To investigate the protective effect of Edaravone on oxygen/glucose deprivation(OGD)-induced rat intestinal epithelial cells damage.［Methods］Cells were divided into normal group(with out OGD，group N)，OGD group(OGD，group IR)and Edaravone treatment group(OGD+edaravone treatment，group E).IEC-6 cells，cultured with serum and sugar free medium，were put in closed incubator filled with 5%CO2and 95%N2mixed gas and two hours latter，cells were changed to normal condition.Edaravone(10 mg/mL)were administered just after OGD treatment in group E.At 2 hs in normal condition，the cells were collected for ROS determination with the DHE probe.At 12 hs post injury，the cells were collected for detections of malonaldehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD).At 24 hs post injury，the cells were used for detection apoptosis with the flow cytometry and cell viability measurement with AlamarBlue.［Results］The DHE probe results showed that the ROS caused by OGD was less in goup E than IR.After OGD，MDA levels were increased to(1.52±0.21)mmol/mg and in Edaravone treatment group，the MDA levels were(1.21±0.16)mmol/ mg(P＜0.05).After OGD，SOD activities were decreased to(7.35±0.84)U/mg and in Edaravone treatment group，the SOD activities were(8.25±1.12)U/mg(P＜0.05).After OGD，cell viability was decreased to 0.48±0.081 and in Edaravone treatment group，cell viability was 0.56±0.049(P＜0.01).Furthermore，the results from the flow cytometry showed that edaravone reduced the OGD-induced cell apoptosis.［Conclusion］Edaravone is an effective for OGD-induced IEC-6 cell damage.

Edaravone;oxygen/glucose deprivation;intestinal epithelial cells;apoptosis

R644

A

1671-7295(2012)04-0348-04

2012-01-12;

2012-06-21

廖青玲(1986-)，女，江西吉安人，护士。E-mail:liaoqingling1986@163.com