吕 涛，李延仓，李树仁，牛希华，娄季鹤

(郑州市第一人民医院烧伤科，河南郑州450004)

依达拉奉对脂多糖引起的小鼠急性肺损伤的保护效应研究

吕 涛，李延仓，李树仁，牛希华，娄季鹤

(郑州市第一人民医院烧伤科，河南郑州450004)

［目的］探讨依达拉奉在急性肺损伤当中的保护效应及其可能的机制。［方法］成年C57小鼠54只被随机等分为3组:正常组(假手术组)，对照组(LPS+生理盐水)和实验组(LPS+依达拉奉)。将对照组和实验组小鼠，采用气道内注入LPS溶液(2 mg/mL)1 mL/kg造急性肺损伤模型，正常组小鼠不注。实验组小鼠尾静脉注射依达拉奉溶液(2 mg/mL)2.5 mL/kg，对照组小鼠注射等体积生理盐水。24 h后，每组取6只小鼠腹腔注射过量麻醉戊巴比妥(100 mg/kg)，后断头处死，取肺组织用于组织学及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、TNF-α，IL-1β和IL-6的检测。每组余下的12只小鼠用做生存率实验，每12 h观测1次并记录小鼠存活的情况，观察周期为4 d。［结果］实验组小鼠生存率明显高于对照组(P＜0.05);LPS刺激后，小鼠肺组织内的MDA含量由(1.41±0.119) nmol/mg上升到(4.48±0.159)nmol/mg，而依达拉奉治疗后则降到(2.56±0.157)nmol/mg(P＜0.01);LPS刺激后，小鼠肺组织内的SOD活力由(12.86±1.49)U/mg下降到(8.95±1.02)U/mg，而依达拉奉治疗后则上升至(10.69± 1.77)U/mg(P＜0.01);同时，LPS刺激后，小鼠肺组织内的TNF-α，IL-1β和IL-6含量分别由(47.89±4.71)pg/ mg、(79.39±3.45)pg/mg和(81.9±6.39)pg/mg上升到(300.48±12.18)pg/mg、(717.99±35.01)pg/mg和(428.99± 21.89)pg/mg，而依达拉奉治疗后小鼠肺组织的含量则降到(191.84±6.43)pg/mg、(236.87±13.46)pg/mg和(136.92±12.47)pg/mg。病理结果显示:依达拉奉减轻了LPS引起的肺水肿，弥漫性出血和炎性细胞的浸润等症状。［结论］依达拉奉可以减轻LPS引起的急性肺损伤。

依达拉奉;脂多糖;急性肺损伤

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ ARDS)是指由心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭。ALI和ARDS具有性质相同的病理生理改变，ARDS是严重的ALI，也是目前病人死亡的主要因素之一［1］。ALI的病因各不相同，发病机制复杂，但被激活的各种细胞经呼吸爆发产生大量活性氧(reactive oxygens pecies，ROS)引起机体氧化应激状态的失衡，在ALI的病理生理过程中起到了重要作用，国内外很多研究已经证实通过外源性的抗氧化剂补给可以减轻LPS导致的ALI［1-3］。依达拉奉是目前临床上广泛应用的一种抗氧化剂。本研究利用气道注射脂多糖(LPS)的方法建立小鼠的急性肺损伤模型，来探讨依达拉奉对小鼠急性肺损伤的保护效应以及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

成年的健康雄性C57小鼠54只，体重20～22 g，购自郑州大学实验动物中心。实验前将小鼠适应性饲养7 d，光照条件为白天/黑夜(12 h∶12 h)循环，任其自由进食。本实验的所有涉及动物实验的操作步骤均得到河南省郑州大学动物伦理委员会同意。LPS和戊巴比妥购自美国Sigma公司。使用前，LPS用医用生理盐水配制成2 mg/mL母液。丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-1β和IL-6检测试剂盒购自美国R&D公司。

1.2 实验分组及方法

将54只小鼠随机分为3组，每组18只。分为正常组(假手术组)，对照组(LPS+生理盐水)及实验组(LPS+依达拉奉)。将对照组和实验组的小鼠用气道注射LPS的方法造急性肺损伤模型。具体过程如下:将小鼠麻醉(腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥)后，使其平躺于恒温动物手术台上，钝性分离暴露气管，用微量注射器通过气管穿刺的方法给小鼠气管内注射1 mL/kg的LPS盐溶液，后将伤口缝合，并用碘伏对缝合区域进行消毒。实验组伤后2 h尾静脉注射2.5 mL/kg的依达拉奉注射(2 mg/mL)溶液，而对照组注射等体积的生理盐水。在伤后24 h，3组各取6只小鼠，均过量麻醉(腹腔注射100 mg/kg体重的戊巴比妥)后断头处死，打开胸腔，分离肺脏，取左肺，用4℃预冷的生理盐水清洗并用滤纸吸干表面液体后立即置液氮内，并在液氮冷冻状态下研磨成粉，储存于-80℃冰箱中用于氧化应激和炎症相关因子的测定;右肺固定于4%的多聚甲醛溶液中用于组织学染色。每组剩余的12只老鼠用做生存率实验，观察周期为伤后4 d，每12 h观测1次，并详细的记录小鼠的死亡时间。

1.3 肺组织中MDA和SOD的检测

肺组织中MDA含量和SOD活性的测定根据商业化的试剂盒说明书所述化学方法进行。具体操作如下:取冻存于-80℃中约100 mg肺组织粉末加入2 mL磷酸缓冲液(pH=7.4)匀浆，12000 g，4℃离心20 min，取上清作MDA和SOD的检测。MDA水平通过与硫代巴比妥酸反应显色的方法在酶标仪中读取535 nm波长处的吸光度(absorbance，A)，MDA含量用nmol/mg蛋白表示。SOD活性通过氮蓝四唑还原法即通过黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶系统还原亚硝酸盐，SOD活性用U/mg来表示。

1.4 肺组织中炎症因子的测定

取冻存于-80℃中的约10 mg肺组织粉末加入0.5 mL磷酸缓冲液(pH=7.4)匀浆，12000 g，4℃离心20 min，取上清用酶联免疫吸附法检测TNF-α、IL -1β和IL-6含量，在450 nm波长处读取A值，根据样品标准曲线计算TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.5 肺组织病理学观察

取出固定于4%多聚甲醛液中肺组织，脱水，石蜡包埋，6 μm连续切片，行常规做HE染色，用普通光镜观察并拍照。

1.6 统计学方法

所得数据采用SPSS 16.0统计软件包处理，文中数据以均数±标准误表示，组间参数比较采用单因素的方差分析，用Kaplan-Meier的统计方法来绘制统计图表，同时用Log-Rank来做生存率检验，将P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 依达拉奉对LPS引起的小鼠生存率的影响

本研究结果显示，实验组的小鼠生存率明显高于对照组，见图1。

图1 依达拉奉对小鼠生存率的影响Fig 1 Effect of edaravone on LPS-induced mice survival rate

2.2 依达拉奉对LPS引起的肺组织炎症反应的影响

伤后24 h的结果显示，实验组IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明显低于对照组。见表1。

表1 依达拉奉对伤后24 h小鼠肺组织炎症反应的影响Tab 1 The effects of edaravone treatment on the LPS-induced inflammatory response in lung tissues at 24 h post-injury

2.3 依达拉奉对LPS刺激后肺组织SOD活力和MDA含量的影响

伤后24 h，实验组肺组织中的MDA含量明显低于对照组，SOD含量明显高于对照组。见表2。

表2 依达拉奉对伤后24 h肺组织中SOD活力和MDA含量的影响Tab 2 Effects of edaravone treatment on MDA content and SOD activity in lung tissues at 24 h post-injury

2.4 依达拉奉对肺组织病理形态的影响

伤后24 h肺组织HE染色结果显示，对照组出现明显肺水肿，弥漫性出血，肺泡间隔增宽和大量炎性细胞的浸润。而实验组，肺损伤的情况得到明显减轻，见图2。

3 讨 论

急性肺损伤是临床上常见的一种疾病，可以由严重感染、创伤和休克等因素诱发，且疾病的进程较快，常发展为ARDS，进而危及患者生命［4-6］。表现为单核巨噬细胞等炎性细胞的浸润和多种细胞因子及黏附分子的过度表达，即出现“细胞因子瀑布”，而肺实质的病变表现为肺水肿、中性粒细胞的浸润、肺泡间隔的增宽同时也伴随着肺细胞的凋亡［2］。氧化应激损伤在急性肺损伤当中发挥着重要的作用，在LPS诱导的急性肺损伤当中，由于大量炎性细胞的浸润，导致呼吸链的爆发，从而导致大量的活性氧(O2-和·OH)产生，而大量的活性氧产生会导致脂质的过氧化、DNA的损伤和蛋白酶的失活进而导致细胞的凋亡［7-8］。所以抗氧化对于控制急性肺损伤的病程十分关键，国内外已经有用各种抗氧化剂，例如:维生素类、N-乙酰半胱氨酸和氢气等来治疗LPS引起的急性肺损伤的相关研究出现［9-10］。

图2 依达拉奉对伤后24 h小鼠肺结构的影响(×200)Fig 2 The effects of edaravone treatment on LPS-induced lung histology changes(×200)

依达拉奉是一种新型的抗氧化剂，目前临床上主要应用于脑中风后的患者。它的主要药理机制是可以中和·OH和ONOO-等［11］。目前研究发现，依达拉奉对于烧伤、博来霉素、急性胰腺炎等引起的肺损伤都有一定的治疗效果，但是对于LPS引起急性肺损伤的研究尚未见报道［12-14］。本研究建立了一个小鼠的急性肺损伤模型，来探讨依达拉奉对于其治疗效果的影响。

组织氧化应激的严重程度取决于体内氧自由基产生的速率与组织和细胞抗氧化能力之间的平衡，组织抗氧化能力则是由各种抗氧化物和酶类自由基清除剂组成。在正常生理情况下，机体的组织和细胞内也存在氧自由基，但它们保持在一个很低水平上发挥其生理功能。机体在组织损伤和应激过程中产生大量自由基，造成自身细胞和组织器官的过氧化损伤。MDA是检测氧化应激损伤和细胞膜脂质过氧化反应程度的常用指标，本研究发现:依达拉奉可以显著的降低小鼠肺组织的MDA的水平，说明依达拉奉可以减轻LPS引起的细胞膜脂质过氧化反应和氧化应激损伤。细胞膜脂质过氧化反应升高和氧化应激损伤不但与氧自由基的过量产生有关，也与机体对氧自由基清除能力降低有关。SOD是体内重要的酶类自由基清除剂之一，LPS刺激同时使肺组织的抗氧化能力降低，肺组织内的SOD活性下降，本研究发现外源性的依达拉奉补给有助于恢复肺组织的抗氧化能力，减轻氧自由基对肺的损伤，这可能是依达拉奉减轻肺损伤的主要机理。

LPS引起的急性肺损伤的病理生理过程中，伴随着大量炎症因子的释放，从而加重肺损伤。TNF-α，IL-1β和IL-6均是与急性肺损伤明显相关的因子，研究证实，在LPS诱导的急性肺损伤中，它们的表达量均显著的上调，本研究发现依达拉奉可以减少LPS刺激后TNF-α，IL-1β和IL-6的产生，从而阻止了炎症反应的放大效应。

LPS引起的肺损伤表现为肺泡间隔的增宽，肺水肿的发生，大量中性粒细胞的浸润，本研究发现通过尾静脉注射依达拉奉可以减轻LPS引起的肺组织的水肿及中性粒细胞的浸润但是依达拉奉抑制肺损伤的机制有待于进一步明确。

依达拉奉对LPS引起的急性肺损伤的保护效应主要是通过减轻肺组织的氧化应激损伤，同时保护了体内自身的抗氧化能力，继而阻止了肺组织促炎性细胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6的产生和释放，最终减轻了肺的病理学改变并降低了小鼠的死亡率。

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Therapeutic efficacy of Edaravone for LPS-induced acute lung injury in mice

LÜ Tao，LI Yan-cang，LI Shu-ren，NIU Xi-hua，LOU Ji-he
(Department of Burn and Plastic Surgery，First People＇s Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450004，China)

［Objective］To investigate the protective effects of edaravone treatment on lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI).［Methods］Fifty-four mice were randomized into 3 groups:normal group(Sham operation)，control group(LPS+physiological saline)and experiment group(LPS+Edaravone).The mice in control and experiment group were induced ALI by intra-tracheal LPS solution(2 mg/kg body weight).The mice in experiment group were given Edaravone solution(2 mg/mL)2.5 mL/kg body weight and the mice in control group were given saline at the same volume.At 24 h post-injury，6 mice in each group were killed and their lung tissues were isolated and assayed for malonaldehyde (MDA)，superoxide dismutase activity(SOD)，TNF-α，IL-1β，IL-6 and histological examination.The remained 12 mice in each group were used for monitoring the survival rate of mice every 12 h for 4 days.［Results］Our experiments exhibited that the survival rate of experiment group was higher than control group(P＜0.05).After LPS stimula-tion，MDA content in the lung tissues was increased from(1.41±0.119)nmol/mg to(4.48±0.159)nmol/mg，whereas it was decreased to(2.56±0.157)nmol/mg in the Edaravone treatment group(P＜0.01).After LPS stimulation，SOD activity in the lung tissues was decreased from(12.86±1.49)U/mg to(8.95±1.02)U/mg，whereas it was increased to(8.95 ±1.02)nmol/mg in the Edaravone treatment group(P＜0.01).After LPS stimulation，TNF-α，IL-1β and IL-6 content in the lung tissues was increased from(47.89±4.71)pg/mg，(79.39±3.45)pg/mg and(81.9±6.39)pg/mg to(300.48±12.18)pg/mg，(717.99±35.01)pg/mg and(428.99±21.89)pg/mg，whereas they were decreased to(191.84±6.43)pg/ mg，(236.87±13.46)pg/mg and(136.92±12.47)pg/mg in the Edaravone treatment group.Edaravone treatment further attenuated lung edema，inflammatory cell infiltrations，widened alveolar septum，and diffuse hemorrhage.［Conclusions］In conclusion，our data demonstrated that ameliorated LPS-induced ALI.

Edaravone;lipopolysaccharide;acute lung injury

R641

A

1671-7295(2012)04-0343-05

2011-12-07;

2012-06-29

吕涛(1970-)，男，河南郑州人，副主任医师。E-mail:lvtao8977@163.com