高 政，姜丽杰，邢芸芸，王旭刚

(1.大连医科大学附属第二医院北院神经内科，辽宁大连116031;2.大连市第三人民医院神经内科，辽宁 大连116031;3.沈阳市第四人民医院心内科，辽宁沈阳110031)

预防性应用盐酸氟桂利嗪对高血糖SD大鼠局部脑缺血再灌注模型ICAM-1表达的影响

高 政1，姜丽杰2，邢芸芸3，王旭刚1

(1.大连医科大学附属第二医院北院神经内科，辽宁大连116031;2.大连市第三人民医院神经内科，辽宁 大连116031;3.沈阳市第四人民医院心内科，辽宁沈阳110031)

［目的］探讨预防性应用盐酸氟桂利嗪对高血糖条件下SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤是否有保护作用及其可能机制。［方法］雄性健康SD大鼠36只，建立高血糖模型后随机分为两组:高血糖组(n=18)与盐酸氟桂利嗪+高血糖组(简称氟桂利嗪组，n=18)，各组按脑缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分为3个亚组。比较氟桂利嗪组与高血糖组各再灌注时间点脑组织病理形态改变及ICAM-1表达的动态变化。［结果］脑组织病理形态观察:氟桂利嗪组随着再灌注时间的延长，脑组织受损程度逐渐加重，但与高血糖组各时间点比较，变性、坏死的神经元较少，组织间水肿较轻。ICAM-1表达:氟桂利嗪组于再灌注3 h可见ICAM-1阳性表达，24 h内逐渐增高(P＜0.05)。氟桂利嗪组与高血糖组比较各时间点缺血区ICAM-1表达均减少(P＜0.01)。［结论］预防性应用盐酸氟桂利嗪能减轻高血糖条件下的局灶性脑缺血再灌注损伤。

盐酸氟桂利嗪;高血糖;脑缺血再灌注;细胞间粘附分子-1

急性脑梗死是临床上常见的急危症之一，具有很高的致死致残率，严重危害人类健康，而急性脑梗死患者在发病前常合并糖尿病或在发病急性期常可见血糖升高，许多临床及动物实验亦表明高血糖可加重脑缺血再灌注损伤［1-4］。细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是中枢神经系统中细胞表达最广泛的粘附分子，它的含量变化被认为能反映颅脑损伤程度。本研究采用SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，通过观察脑组织病理形态改变和ICAM-1表达情况，探讨预防性应用盐酸氟桂利嗪(flunarizine hydrochlorid)对高血糖条件下的脑缺血再灌注损伤是否有保护作用，为预防性用药提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠36只，体重180～220 g，血糖正常(＜6 mmol/L)，由大连医科大学动物实验中心提供，分笼温室饲养，自由进食饮水，自然昼夜，术前禁食12 h。

1.2 主要药品、试剂和仪器

兔抗大鼠ICAM-1抗体(福建迈新公司);SP试剂盒、DAB显色剂(美国SANTAZ公司);氯化三苯四唑啉(TTC)(中国医药集团上海化学试剂公司);盐酸氟桂利嗪(西安杨森公司5 mg/片);DS-88型电子称(武汉自动化仪表厂);电热恒温水温箱HW1型(北京市医疗设备厂);LEICA-RM-2145石蜡切片机(德国);NIKON数码相机(日本);OLYMPUS光学显微镜(日本);微血糖仪(美国强生公司); HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组:36只健康雄性SD大鼠，按随机化原理分为两组:高血糖组(n=18)、盐酸氟桂利嗪+高血糖组(简称氟桂利嗪组，n=18)。各组按脑缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n= 6)分为3个亚组。

1.3.2 给药方法:盐酸氟桂利嗪研磨成粉末状，生理盐水稀释溶解成混悬液。给药组大鼠在手术前3 d灌胃，1次/d，按分组情况分别给盐酸氟桂利嗪(10 mg/kg)。

1.3.3 大鼠高血糖模型制备:大鼠术前禁食12 h，自由进水。各组在阻断大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)前30 min腹腔注射50%葡萄糖溶液(3 g/kg)。于注射葡萄糖前及栓线前各取鼠尾血1滴，用血糖仪测定血糖浓度，栓线前血糖值＞11.1 mmol/ L表示建模成功。

1.3.4 大鼠大脑中动脉闭塞的缺血再灌注模型制备:参照改良的Longa-Zea氏线栓法［5］制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。模型成功的标志是动物苏醒后出现同侧的Horner征(眼裂变小，眼球内陷)和对侧以前肢为重的偏瘫。

1.3.5 观察指标:免疫组织化学法测定ICAM-1的表达。判断标准:每张切片在40×10倍光镜下随机选取缺血区内5个不重叠的视野，显微镜下观察并计数阳性细胞，应用HPIAS-1000图像分析处理系统计数ICAM-1免疫反应阳性细胞数量，取均值作为各时间点阳性表达细胞数。

1.4 统计学方法

所有数据均以x ±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。血糖值采用配对t检验;两组间的比较采用成组t检验;ICAM-1在氟桂利嗪组的动态变化采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异具有显著性意义，P＜0.01表示差异具有非常显著性意义。

2 结 果

2.1 脑组织病理形态检查结果

高血糖组:脑缺血区神经元数目减少，神经细胞皱缩、变性，可见空泡化改变，与周围分界清楚，胞核固缩，组织间水肿明显，随着再灌注时间延长，缺血神经元损害加重，呈不可逆性神经细胞损伤性改变，绝大多数神经细胞坏死。见图1。

图1 高血糖组(40×10)Fig 1 Hyperglycemia group(40×10)

氟桂利嗪组:随着再灌注时间的延长，脑组织受损程度也逐渐加重，但与高血糖组相同再灌注时间点比较，变性、坏死的神经元减少，空泡化改变减轻，组织间水肿减轻。见图2。

图2 氟桂利嗪组(40×10)Fig 2 Flunarizine group(40×10)

2.2 ICAM-1表达结果

氟桂利嗪组于再灌注3 h可见ICAM-1阳性表达，24 h内逐渐增高，组内6 h与3 h比较P＜0.01，24 h与6 h比较P＜0.05;相同再灌注时间点氟桂利嗪组与高血糖组比较缺血区ICAM-1表达减少，且差异有非常显著性意义，P＜0.01。见表1。

表1 各组不同再灌注时间点ICAM-1的表达Tab 1 Different reperfusion time points ICAM-1 expression in each group (x ±s)

3 讨论

脑血管病是严重危害人类生命安全的三大疾病之一，其中缺血性脑血管病占大多数，严重危害人类健康。而长时间的脑缺血后再灌注期间组织发生复杂的继发性改变，加重组织损伤。目前认为脑缺血再灌注损伤的机制包括兴奋性氨基酸的释放、炎症反应、基因表达的改变及细胞内钙超载等。而细胞内钙超载被认为是引起缺血再灌注损伤的重要环节。临床发现脑缺血患者发病前常合并糖尿病或者在发病急性期常可见血糖升高，许多临床及动物实验也已证明高血糖可以加重脑缺血再灌注损伤。盐酸氟桂利嗪作为第四代Ca2+拮抗剂，具有抑制病理性过量Ca2+内流而不影响正常Ca2+向细胞内流入的作用，是目前钙通道阻滞剂中能透过血脑屏障的药物之一，作用于神经元及血管的电压依赖性钙通道，从而阻滞脑缺血再灌注条件下的Ca2+内流，目前临床已普遍应用于治疗早期缺血性脑梗死。张秋铃等［5］进行动物实验研究发现预防性应用盐酸氟桂利嗪能明显减轻缺血再灌注对神经细胞的损伤，但至今为止，关于预防性应用盐酸氟桂利嗪对高血糖条件下的脑缺血再灌注损伤保护作用的研究国内外尚未见报道。本实验对脑缺血区的形态学观察发现，高血糖组缺血区神经元数目减少，神经细胞皱缩，变性，可见空泡化改变，与周围分界清楚，胞核固缩，组织间水肿明显，随着再灌注时间延长，缺血神经元损害加重，呈不可逆性神经细胞损伤性改变，绝大多数神经元坏死。氟桂利嗪组随着再灌注时间延长，组织受损程度也逐渐加重，但与高血糖组各再灌注时间点比较变性、坏死的神经元减少，空泡化改变减轻，组织间水肿减轻。

炎症反应是脑缺血再灌注损伤的重要因素，其最重要的功能是将白细胞输送到损伤部位，而白细胞和血管内皮细胞之间的粘附是白细胞浸润的关键步骤。此过程的始动因素部分是由于在脑血管内皮细胞表达的细胞间粘附分子ICAM-1和其配基，在白细胞表面表达的整合素分子CD11/CD18糖蛋白相互作用而引起的。ICAM-1属粘附分子中的免疫球蛋白超家族，是中枢神经系统中细胞表达最广泛的粘附分子，脑中几乎所有的细胞如小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经细胞均有ICAM-1的表达，但其在微血管内皮细胞表达最强［6］。正常情况下ICAM-1呈低表达，在感染、脑梗死等状态下血清中ICAM-1含量出现显著升高，尤其在急性脑梗死患者血清中ICAM-1增高程度与神经功能缺损程度及梗死灶大小密切相关，故认为ICAM-1含量变化反映出颅脑损伤程度［7］。动物实验已经证实:通过针对ICAM-1拮抗剂或抑制剂可以明显减轻脑损伤后的脑水肿［8］。另外，抗ICAM-1抗体使脑缺血后缺血区损伤减少，并可明显减小脑梗死面积及缺血区组织中多型核白细胞的数目，推迟缺血后炎症发生的时间，并可明显降低缺血区凋亡细胞数，目前，已经有抗黏附分子单克隆抗体成功的用于实验鼠治疗脑缺血再灌注损伤，且收到良好的效果，并证明有神经保护、减轻脑损伤的作用［9-10］。本实验发现氟桂利嗪组再灌注3 h可见ICAM-1阳性表达，24 h逐渐增高。周华东等［11］研究大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注不同时间内皮细胞ICAM-1表达发现，再灌注2 h ICAM-1开始升高，至48 h达到高峰，持续1周以上。

本实验对氟桂利嗪组与高血糖组各再灌注时间点ICAM-1的表达情况进行了比较，发现相同再灌注时间点氟桂利嗪组ICAM-1的表达比高血糖组减少，且两者差异具有显著性意义。说明盐酸氟桂利嗪对神经细胞的保护作用与减少ICAM-1表达，减轻炎症反应有关。有文献报道高血糖在缺血早期可以引发大量的白细胞在缺血区的聚集，这是高血糖加重脑缺血损伤的原因之一［12］。生理状态下，粘附分子只有低水平的表达，而在缺血期间其在内皮细胞上的表达增加，这种反应对白细胞粘附尤为重要，是促进白细胞跨内皮迁移的必要过程［13］。而有研究发现ICAM-1与整合素分子CD11/CD18作用后能引起白细胞和内皮细胞内Ca2+浓度的增加［14］，从而激活内皮细胞，使ICAM-1表达上调，介导更多的白细胞粘附，形成正反馈过程。Barnett等［15］的实验亦发现稳定细胞内Ca2+浓度能阻止ICAM-1mRNA表达上调。而盐酸氟桂利嗪作为电压依赖性钙离子通道阻滞剂可以通过阻止病理条件下的Ca2+内流，从而使ICAM-1表达减少。Etienne等［16］的实验还观察到ICAM-1能够激活蛋白激酶c，催化ip3生成，引起细胞外Ca2+内流和细胞内钙库释放Ca2+，引起细胞内钙超载。Ca2+作为第二信使能够启动多种反应，包括引起细胞骨架修饰，进一步使血脑屏障内皮细胞间的连接松弛，以利于白细胞对缺血脑组织的趋化浸润。综上所述，盐酸氟桂利嗪不仅可以阻止细胞内钙超载，而且可以抑制ICAM-1的表达，从而打断了这种ICAM-1偶联的Ca2+信号转导，阻止白细胞在缺血区的聚集，起到脑保护的作用。

本研究无论是从组织形态还是从分子水平上，都证实了预防性应用盐酸氟桂利嗪对缺血前高血糖大鼠局部脑缺血再灌注损伤的保护作用。

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Effect of pretreatment by flunarizine hydrochlorid on focal cerebral ischemia reperfusion damage and the expression of ICAM-1 in rats with hyperglycemia

GAO Zheng1，JIANG Li-jie2，XING Yun-yun3，WANG Xu-gang1
(1.Department of Neurology，The North Hospital of Dalian Medical University No.2 Affiliated Hospital，Dalian 116031，China;2.Department of Neurology，Third People’s Hospital of Dalian，Dalian 116031，China;3.Department of Cardiology，Fourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031，China)

［Objective］To investigate whether pretreatment with flunarizine hydrochlorid could relieve the injury of local cerebral ischemia-reperfusion in rats with hyperglycemia.［Method］Thirty six healthy male SD rats(weight from 180 g to 220 g)were randomly divided into 2 groups:hyperglycemia group(n=18)and flunarizine+hyperglycemia group(flunarizine group n=18).The rats in each group were divided into 3 subgroups according to reperfusion 3 h(n=6)，6 h(n=6) and 24 h(n=6)after ischemia for 90 minutes.The differences of cerebral pathological changes and the expressions of ICAM-1 among these groups.［Result］Compared with hyperglycemia group，the number of degenerative and necrosis neurons were less and tissue edema became was weaker.In the flunarizine group，the expression of ICAM-1 can be seen at 3 hours from reperfusion，and increase in 24 hours from reperfusion，P＜0.05.Compared with hyperglycemia group at every reperfusion time:ICAM-1 expressions were decreased in flunarizine group，P＜0.01.［Conclusion］The pretreatment of flunarizine hydrochlorid could decrease the expression of ICAM-1 and the focal ischemia-reperfusion damage of the ras with hyperglycemia.

flunarizine hydrochlorid;hyperglycemia;ischemia reperfusion;ICAM-1

Q95-33

A

1671-7295(2012)04-0339-04

2011-12-26;

2012-05-21

高政(1965-)，男，辽宁大连人，教授，主任医师。E-mail:bygzyz@163.com