赵玉娟，李盛钰，牛春华，张雪，李达，杨贞耐

（吉林省农业科学院农产品加工中心国家乳品加工技术研发分中心，长春 130033）

植物乳杆菌K25对小鼠急性毒性和细菌移位实验研究

赵玉娟，李盛钰，牛春华，张雪，李达，杨贞耐

（吉林省农业科学院农产品加工中心国家乳品加工技术研发分中心，长春 130033）

通过小鼠急性毒性和细菌移位实验，评价植物乳杆菌K25口服安全性。小鼠连续14 d灌胃不同剂量的植物乳杆菌K25，各试验组小鼠在一般体征、脏器指数、血清和肝脏生化指标与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。且各剂量组小鼠血液、肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结匀浆液中均未检测到植物乳杆菌K25，说明未出现菌血症变化和细菌移位现象。上述结果均表明植物乳杆菌K25安全无毒副作用。关键词：植物乳杆菌；安全性评价；急性毒性；细菌移位

0 引言

乳酸菌的应用可追溯到二千多年前[1]，但最新研究表明可从菌血症、心内膜炎和脑膜炎等患者体内分离出乳酸菌[2]，虽然这类报道病例相对较少，但却引起人们对乳酸菌安全性问题的广泛关注，尤其是即将引入人类食物链中的新菌株。因此对新分离的乳酸菌进行安全性评价显得十分必要。

植物乳杆菌K25是本实验室由西藏灵菇中自主分离得到。经体内外实验表明该菌株具有良好的耐酸、耐胆盐、细胞黏附作用，以及较好的降血脂和抗氧化功效(研究结果将另文发表)，是一株具有潜在益生特性的新菌株。因此，本研究按照相关国家标准，通过小鼠急性毒性和细菌移位试验进行相关毒理检测，评价植物乳杆菌K25的安全性，为该菌株进一步的应用开发提供安全实验依据。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株与培养基

植物乳杆菌(L.plantarum)K25[3]菌株在体积分数为30%甘油的MRS培养基中，-80℃冻存，使用前接种于MRS液体培养基，37℃连续活化3次。

液体MRS[4]培养基用于培养菌株，固体MRS培养基用于乳杆菌的活菌计数。

SS琼脂培养基[5]用于沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌等肠道致病菌的活菌计数。

将活化的植物乳杆菌K25按体积分数为3%接种量接种于MRS液体培养基，37℃培养16 h，离心(8 000 r/min，4℃，10 min)，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤2次后，无菌生理盐水调整菌液浓度为2.1×1011，2.1×109和2.1×107mL-1，分别作为小鼠高、中和低灌胃剂量的菌悬液。

1.1.2 实验动物

健康昆明种小鼠，体重18～22 g，清洁级，6周龄，购于长春高新医学动物实验研究中心。购回后进行适应性饲养3 d后分组进行试验。试验前禁食16 h，但不限制饮水。动物房温度为（22±2）℃，相对湿度为50%±5%。

1.1.3 仪器与试剂

Cary 300 UV-VIS分光光度计，CR3i高速冷冻离心机，FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器，BCH-1360B型生物洁净工作台。

谷草转氨酶(GOT)测定试剂盒，谷丙转氨酶(GPT)测定试剂盒，谷胱甘肽巯基转移酶(GST)测定试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒，尿素氮(BUN)测定试剂盒等，均购自南京建成生物工程有限公司。

1.2 急性毒性实验

1.2.1 实验方案

参照GB15193.3-2003[6]寇氏(korbor)法，将小鼠随机分为高、中、低剂量和空白对照组，每组10只，雌雄各半。适应性饲养后高、中、低剂量组小鼠连续14 d灌喂不同剂量的植物乳杆菌K25菌悬液20 mL/(kg·d)，对照组小鼠灌胃等量无菌生理盐水。

1.2.2 一般体征的观察

每日清晨称量并记录小鼠体重、采食量(FI)。每12 h观察小鼠的精神、运动、呼吸和死亡等状况。计算小鼠的消费指数(CI)即采食量(FI)与体质量增重(WG)之比[7]。

1.2.3 脏器指数及肝脏、肾脏功能的测定

试验结束前12 h禁食，但不限制饮水。饲养结束时称量小鼠体重后摘除眼球并收集血液，分离血清测定丙二醛和尿素氮。摘取肝脏、肾脏、脾脏和心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，各脏器重量与小鼠体重比值的百分数即为脏器指数。

准确称取各组小鼠的肝脏0.5 g，加入4.5 mL无菌生理盐水，匀浆后离心取上清液，制备成肝组织匀浆液，用于谷草转氨酶(GOT)活性，谷丙转氨酶(GPT)活性，谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性和丙二醛(MDA)活性测定。蛋白含量采用Lowry等[8]的方法测定。

1.3 细菌移位

参照Zhou等[9]方法，将40只雄性小鼠随机分为高、中、低剂量和空白对照组，每组10只，经适应性饲养后高、中、低剂量组小鼠连续14 d灌喂不同剂量的植物乳杆菌K25菌悬液，灌喂剂量为20 mL/(kg·d)，对照组小鼠灌胃等量无菌生理盐水。末次处理24 h后，乙醚麻醉小鼠，无菌心脏穿刺取血并收集血液样本。解剖小鼠，无菌棉签擦拭脏器表面，涂布于MRS和SS固体培养基，检测小鼠内脏表面是否污染。无菌摘取肠系膜淋巴结(MLN)、脾脏和肝脏[10]，制备成组织匀浆液，分别取0.1 mL血液和脏器匀浆液，涂布于MRS、SS固体培养基。将各培养基于37℃培养48～72 h，记录各培养基上有植物乳杆菌K25菌落生长的小鼠数量，即使有一个菌落生长也认定为阳性细菌移位，按下列公式计算细菌移位发生率，即

细菌移位发生率（%）=有K25菌落生长的小鼠数量/受试小鼠总数×100%。

1.4 数据分析

采用DPS软件处理数据。计量资料以表示；计量资料组间差异比较采用ANOVA统计分析。

2 结果与讨论

2.1 一般体征观察

在灌胃植物乳杆菌K25活菌液的试验过程中，小鼠生长和精神状况良好，摄食、饮水、呼吸和排泄等方面均正常，未出现腹泻、疾病病例，到试验结束为止，无一例中毒或死亡病例。并且各试验组小鼠的被毛光滑且有光泽，试验组和对照组之间无明显差异。各组小鼠体重变化情况如图1所示。小鼠在灌胃期间，体重均呈增加趋势，与灌胃前相比，除低剂量组增长较少外(7～8 g)，灌胃14 d后各组体重均增加9～11 g，各剂量组与对照组相比无明显的体重变化规律，不同剂量组之间无剂量效应，差异性不显著(P＞0.05)，即表明在试验期间，各小鼠体重增长与灌喂植物乳杆菌K25菌悬液之间无明显的关联作用。结果与Zhou[9]和Tasaki[11]研究结果相一致。

各试验小鼠灌服植物乳杆菌K25后消费指数的变化情况如表1所示。饲养至第5天时，高、中剂量组的雄性和雌性小鼠和低剂量组的雄性小鼠CI均低于对照组，差异显著(P＜0.05)，说明在灌服植物乳杆菌的初期，一定程度上提高了小鼠对饲料利用效率。Bernardeau等[7]将L.rhamnosusMA27/6B和L.acidophilusMA27/6R通过饮水的方式让小鼠连续服用17天后，发现服用108CFU/mL的活菌/死菌液处理组小鼠的消费指数均明显低于对照组。而随着饲养时间的延长，各实验组小鼠的消费指数差异不显著(P＞0.05)。而低剂量组雌性小鼠的CI均高于对照组，并且在小鼠适应性饲养期间发现这些小鼠体质相对较弱，生长缓慢，因此对饲料的利用率相对较差。

表1 各组小鼠灌服植物乳杆菌K25后消费指数的变化情况(n=5，±s)

表1 各组小鼠灌服植物乳杆菌K25后消费指数的变化情况(n=5，±s)

注：*为与对照组相比数据间差异显著（P＜0.05）。

饲养5 d饲养10 d饲养14 d组别高剂量组中剂量组低剂量组对照组雄性9.12±1.41 9.54±1.22 9.54±1.37 12.36±1.16*雌性9.85±1.36 9.33±1.31 12.47±1.16 11.55±1.24*雄性14.23±1.15 13.94±0.87 13.51±1.59 13.85±1.28雌性16.99±1.22 16.43±1.77 18.48±1.53 16.62±1.12雄性15.84±1.03 15.29±1.55 15.66±1.24 15.46±1.49雌性18.16±1.79 18.43±1.48 19.74±2.18 18.67±1.01

2.2 小鼠急性毒性实验

根据急性毒性实验国标(GB 1519313-2003)得出以下结论：小鼠连续灌胃植物乳杆菌K25半数致死量(LD50)大于4.0×1012kg-1，小鼠未出现异常表现，如精神不振、死亡等现象。查表得知，植物乳杆菌K25为无毒级别。最大耐受剂量(MTD)大于4.0×1012kg-1。

2.3 脏器指数的测定

图2为灌服植物乳杆菌K25后小鼠脏器指数的变化情况。由图2可以看出，各组小鼠灌胃14 d后，心脏指数在0.4%～0.5%、肝脏指数在4.8%～5.3%、肾脏指数在1.32%～1.4%之间波动，各组之间差异不显著(P＞0.05)。中剂量组的脾脏指数与其他组相比差异显著(P＜0.05)，但是这种脾脏指数的波动无明显的剂量效应，所以小鼠脾脏指数的变化与灌服植物乳杆菌无相关性。心脏指数是反映身体健康情况的一个指标，肝和肾是身体重要的排毒解毒器官，其指数变化程度可以从另一方面反映灌胃物质的毒性程度[12]，而本研究中各试验组小鼠的体重和脏器重量无明显的变化，结果与孙洁宇[12]和Kai-Chien Lee[10]相一致。

2.4 生化指标的测定

各组小鼠血清MDA浓度变化如图3所示。由图3可以看出，血清MDA浓度在11～13 nmol/mL之间波动，且各组之间差异不显著(P＞0.05)，且试验组小鼠的MDA浓度低于对照组，证明当给小鼠灌胃植物乳杆菌K25后，没有引起小鼠的败血症病变。

尿素氮（BUN）是机体蛋白质代谢的主要终末产物之一，当肾脏功能受损而引发肾脏疾病，如慢性肾炎、肾盂肾炎等，则血尿素氮的浓度升高。本研究中各组小鼠的血尿素氮浓度变化如图4所示，BUN浓度在7.3～7.8 mmol/L之间波动，各实验组的BUN浓度均低于对照组，且各实验组之间差异不显著(P＞0.05)，说明灌胃植物乳杆菌K25未引起各剂量组小鼠肾脏功能的改变。

谷胱甘肽S-转移酶(GST))属Ⅱ相代谢酶系，是催化外来化合物的中间代谢产物与谷胱甘肽(GSH)结合的关键酶，谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)是参与氨基酸代谢的酶，是肝脏功能损害最敏感的检测指标，当肝细胞轻度受损时上述三种酶活性即发生明显的变化，指示肝功能的急性受损。植物乳杆菌K25对小鼠肝功能的影响如表2所示，各试验组小鼠的谷丙转氨酶活性相似，组间差异不显著(P＞0.05)；与对照组相比，高、低剂量组小鼠的谷胱甘肽S-转移酶、丙二醛和谷草转氨酶活性差异不显著(P＞0.05)，且二者组间差异不显著。而中剂量组中小鼠肝组织功能的变化无明显的剂量效应，说明实验鼠经14 d灌胃植物乳杆菌K25，未引起肝脏组织功能的损伤。

2.5 细菌移位的测定

细菌移位是益生菌安全性评价中重要的评价内容之一，细菌移位是肠道条件性菌株发生致病性的第一步。最新的研究表明由于完整的肠屏障被打破，或免疫功能低下，或者在潜在的疾病条件下服用乳酸菌后发生细菌移位，诱导菌血症、败血病和心内膜炎等疾病的发生[13-14]。至2007年，国外报道了至少73例与乳杆菌相关的心内膜炎病例，最常被分离得到的菌株是干酪乳杆菌，随后是鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌[15]。因此，采用动物试验对乳酸菌的移位能力进行评估是很必要的。

表2 各试验组小鼠肝组织酶活力的变化情况U/mg

表3 各试验组小鼠的细菌移位情况

植物乳杆菌K25的细菌移位评价结果见表3。根据阳性细菌移位判定标准，即在乳酸菌选择性培养基MRS中有1个菌落也为阳性，而各小鼠的脏器表面、肠系膜淋巴结(MLN)、脾脏、肝脏和血液的MRS培养基均未检测到任何细菌的生长，说明植物乳杆菌K25不会发生通过肠道屏障到达肠系膜淋巴结和肠腔外其他器官的细菌移位现象。这与已报道的一些乳杆菌如干酪乳杆菌Zhang[12]、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）GG[16]、唾液乳杆菌（L.salivarius）CECT5713[17]、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）LA-1[18]、鼠李糖乳杆菌HN001、嗜酸乳杆菌HN017、乳双歧杆菌HN019[19]、德氏乳杆菌UO 004[20]和乳酸乳球菌NZ9000[10]不发生细菌移位的结果相一致。

采用MRS和SS培养基对各组小鼠的血液进行培养，均无任何细菌生长，说明各试验组各剂量的小鼠均未出现菌血症。而有少部分SS琼脂培养基中培养出黑色、有金属光泽的菌落，这是典型的沙门氏菌菌落。如低剂量组1份小鼠的脏器表面、MLN、肝脏和脾脏均培养出沙门氏菌菌落，分析原因是该小鼠可能患有沙门氏菌感染，因为在饲养过程中，低剂量组有一只小鼠生长缓慢、行动迟缓，结合细菌培养结果分析该小鼠是因为感染沙门氏菌病而导致生长缓慢。另外，对照组2份小鼠的MLN中检出沙门氏菌菌落，而其他组织器官均未检出沙门氏菌，分析原因是在分离肠系膜淋巴结时误将小肠段混入，而带入了沙门氏菌。

3 结论

急性毒性试验结果表明，小鼠口服植物乳杆菌K25最大耐受剂量(MTD)大于4.0×1012kg-1，根据急性毒性试验国家标准(GB15193.3-2003)可以得出植物乳杆菌K25为无毒级别。小鼠血清和肝组织匀浆液的各项生化指标分析结果表明，植物乳杆菌K25未引起小鼠肝脏和肾脏功能的改变。另外，灌胃植物乳杆菌K25活菌液不能引起小鼠菌血症和细菌移位。上述实验结果表明植物乳杆菌K25是安全无毒的，并为该菌株的进一步应用提供了理论依据。

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Acute oral toxicity and bacterial translocation evaluation of Lactobacillus plantarum K25

ZHAO Yu-juan,LI Sheng-yu,NIU Chun-hua,ZHANG Xue,LI Da,YANG Zhen-nai
(Center of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,National R&D Center for Milk Processing, Changchun,130033，China)

To evaluate the safety ofLactobacillus plantarumK25,we carried out the acute oral toxicity and bacterial translocation in mice.Different dose ofL.plantarumK25 were given to mice orally by gavage for 14 consecutive days.Compared with control,there are no significant differences(P＞0.05)in general signs,organs index,and biochemistry parameters of serum and liver with different dose ofL.plantarumK25. We don’t detecte the treatment-associated bacterial translocation in blood and homogenate of liver,kidney and mesenteric lymph nodes (MLN).The result of acute toxicity and bacterial translocation shows thatL.plantarumK25 has no toxicity and side effects.

Lactobacillus plantarum;safety assessment;acute toxicity;bacterial translocation

Q93-33

A

1001-2230（2012）05-0009-04

2011-11-29

国家自然科学基金项目（No31071574），农业部现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目（CARS-37）和吉林省博士后基金项目（200904008）共同资助。

赵玉娟（1980-），女，助理研究员，研究方向为乳品微生物与功能评价。

杨贞耐