张吉丽+司鸿飞+李冰+程富胜+周绪正+张继瑜

摘要：为了对五氯柳胺混悬剂的安全性进行评价，采用简化寇氏法进行了大鼠的急性毒性研究。首先通过预试验的最小致死剂量（LD100）和最大耐受剂量（LD0）确定给药剂量及试验分组。灌胃给药，观察7 d， 记录死亡数，计算LD50及95%的置信区间。结果表明，五氯柳胺混悬剂对大鼠的急性毒性LD50为3.333 g/kg，95%的置信区间为3.084 6～3.600 8 g/kg。表明如按照化学药物剂量分级，五氯柳胺混悬剂可认定为低毒物质。

关键词：五氯柳胺混悬剂；大鼠；急性毒性；LD50

中图分类号：S855.9；S859.79+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5313-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.036

Abstract： A acute toxicity test of oxyclozanide suspension on rats was taken to evaluate its safety by simplified Karbers method. The dosage and grouping were determined based on the minimum lethal dose（LD100） and the maximum tolerated dose（LD0） in preliminary experiment. The rats were gavaged with oxyclozanide suspension and observed seven days. The number of deaths was recorded for calculating the LD50（lethal dose 50%） and the 95% confidence limit. The results showed that the acute toxicity LD50 of Oxyclozanide suspension on rats was 3.333 g/kg，95% confidence limit ranges was from 3.084 6 g/kg to 3.600 8 g/kg. It indicated that the oxyclozanide suspension was low-toxic drug according to chemically drug classification.

Key words： oxyclozanide suspension； rats； acute toxicity； LD50

肝片吸虫病（Fascioliasis hepatica）是由肝片吸虫引起的食源性的人畜共患病。该病遍及欧洲、亚洲、非洲、美洲和大洋洲等区域[1]。患病动物出现消瘦、贫血、使役能力下降、乳牛产奶量降低等症状，严重阻碍了畜牧养殖业的健康发展，对保障食品安全、公共卫生安全和环境生态安全构成了极大的威胁，同时也造成了严重的经济损失[2，3]。目前对肝片吸虫的防治与其他蠕虫一样，主要依靠化学药物进行控制。五氯柳胺混悬剂为水杨酰苯胺类化学合成类抗吸虫药物，主要用于抗牛、羊的肝片吸虫感染，对绦虫和线虫也有较好的治疗效果[4]。它可以抑制虫体线粒体中氧化磷酸化过程，阻碍能量（ATP）生成，使虫体因能量耗尽而死[5]。国外对于五氯柳胺的研究较早，特别是在印度、英国、美国等寄生虫感染的高发病地区，已有大量研究表明该药具有较好的驱虫效果，应用十分广泛[6-8]。但由于该药不溶于水，国内并未对该药进行系统性研究，相关报道较少。笔者制备了五氯柳胺混悬剂，前期试验解决了制备工艺问题以及临床方便给药、储藏运输等实际需求。本试验以大鼠为试验动物进行五氯柳胺混悬剂的急性毒性试验，旨在为指导临床科学、安全地使用该混悬剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物：SPF级SD大鼠110只，购自北京维通利华实验动物有限公司。体重在180～220 g，雌雄各半，雌性未产未孕。试验前饲养3～5 d，以适应试验环境。

药品：五氯柳胺混悬剂，由农业部兽用药物创制重点实验室制备。试验前，精密称定处方中主药及辅料，配制成0.209 g/mL的混悬剂，待用。按照处方中各辅料的用料配比，配制辅料对照组（不含主药五氯柳胺）的浓度为0.1 g/mL。

1.2 方法

1.2.1 预试验 采用递加法分别进行五氯柳胺混悬剂组预试验以及辅料对照组预试验。

五氯柳胺混懸剂预试验：将20只SD大鼠平均分为5组，每组4只，雌雄各半，分别给大鼠称重，计算给药剂量。最高剂量组为5.0 g/kg，最低剂量组为1.0 g/kg。灌胃给药，观察7 d，记录大鼠的死亡数，得到最小致死剂量（LD100）（记为b）和最大耐受剂量（LD0）（记为a）。确定组数N以及各组间剂量比r。

N由预试验的最小致死剂量（LD100）b与最大耐受剂量（LD0）a的比值来确定。

r=lg-1[（lgb-lga）/（N-1）]

辅料对照组预试验方法同上。

1.2.2 正式试验 由预试验结果可知，辅料预试验的LD100大于5.0 g/kg，将大鼠样本量增至10只，雌雄各半，仍未出现死亡现象，按照化学药物毒性分级属于实际无毒，因此得到结论，该混悬剂辅料实际无毒。根据五氯柳胺混悬剂预试验得到的最小致死剂量（LD100）和最大耐受剂量（LD0），采用简化寇氏法计算正式试验组数N以及各组间剂量比r。

根据五氯柳胺混悬剂预试验结果将正式试验分为6组，其中包括空白对照组1组以及不同剂量给药组5组。将60只SD大鼠（雌雄各半，体重180～220 g）随机分为6组，每组雌雄各半。试验组的给药剂量分别为5.000、3.375、2.250、1.500、1.000 g/kg，空白对照组给予等量的饮用水。灌胃给药，观察7 d，自由饮水，采食，观察大鼠的外观体征、饮食欲、行为活动、大小便等相关症状。给药后4 h，持续观察；4～8 h内每30 min观察一次；8～12 h，每1 h观察一次；12～48 h，每隔3 h观察一次；3 d后每天观察3次，直至第七天结束。记录每组死亡大鼠个数，对死亡动物进行剖检，与空白组对照，观察各组织器官的病理变化。用改良寇氏法计算LD50及95%的置信区间。

2 结果与分析

2.1 预试验结果

辅料预试验组的LD100大于5.0 g/kg，增加试验动物数量至10只，仍未出现死亡现象，按照化学药物的毒性分级可以视为实际无毒。

五氯柳胺混悬剂试验组预试验的LD100为5.0 g/kg，LD0为1.0 g/kg。从而确定正式试验的组数N为5。各组之间的剂量比值r=1.495。由此将预试验分为6组，其中5组为不同剂量给药组，1组为空白对照组。

2.2 正式试验结果

观察给药后动物表现出的症状为：大鼠被毛逆乱、精神沉郁，伏卧不动，眼睛微闭，食欲不振，对外界刺激反应迟钝，个别大鼠出现四肢无力、粪便变软，少数大鼠出现后肢瘫痪等现象，死亡前出现全身震颤、侧翻现象，大约持续5～10 min死亡。高剂量组的症状明显，低剂量组症状较轻微，恢复快。大鼠死亡时间集中在8～15 h，2 d后再无死亡现象，症状逐渐缓解。

对死亡动物剖检，与空白对照组相比，死亡动物的口唇、四肢、尾巴青紫。高剂量组中，个别大鼠出现脾肿大、肝有出血点、胃部膨大、胃壁变薄等现象。

正式试验死亡情况见表1。根据简化寇氏法计算LD50以及95%置信限公式如下：

式中，Xm为最大剂量的对数；i为组距，即相邻两组剂量对数值之差；p为各剂量组死亡率，q为各剂量组存活率；∑p为各剂量组死亡率之和；n为各组动物数；sx50为lgLD50的标准误差。

计算得到LD50为3.333 g/kg，95%置信区间为3.084 6～3.600 8 g/kg。根据化学物急性毒性（LD50）剂量分级可知五氯柳胺口服混悬剂为低毒物质。

3 小结与讨论

本试验严格遵守《兽药研究技术指导原则汇编》[9]中对药物急性毒性试验的相关规定。试验采用SPF级SD大鼠作为试验动物，保证试验动物健康无污染，以防对试验结果造成影响。由于高剂量组药物浓度较大，液体较黏稠，稀释后给药体积较大，考虑到大鼠的胃容积，为防止撑死现象的发生，采用多次给药。给药间隔为1～2 h，24 h内给药完成。

由试验结果可知，大鼠给予五氯柳胺混悬剂后，出现精神倦怠、食欲减退、生长迟缓等現象，根据大鼠的死亡数计算五氯柳胺混悬剂的半数致死剂量（LD50）为3.333 g/kg，95%置信区间为3.084 6～3.600 8 g/kg。由化学物毒性分级可知，五氯柳胺混悬剂为低毒物质，临床用药安全。五氯柳胺作为广谱抗寄生虫药，具有广谱高效、无耐药性等特点[10]，本研究对其新制剂五氯柳胺混悬剂的安全性进行了评价，以期为该制剂的后续研究及临床推广应用奠定基础。

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