徐英操，冯志彪

(东北农业大学理学院应用化学系，哈尔滨 150030)

磁性微球固定化Alcalase酶与水解酪蛋白动力学模型的建立

徐英操，冯志彪

(东北农业大学理学院应用化学系，哈尔滨 150030)

采用化学沉积过程，以羟基Fe3O4为核、SiO2为壳进行核壳包被，再以氨基硅烷化试剂和戊二醛为交连试剂实现Alcalase酶的固定化，电镜及红外谱图分析作为表征手段，并将其用于酪蛋白的水解过程，通过双曲线回归模型建立水解全过程动力学模型。

固定化Alcalase；磁性高分子；酪蛋白水解

0 引言

纳米磁性高分子微球具有超顺磁性，作为酶的结合载体，使得固定化酶在外加磁场作用下从水解反应体系中实现有效的磁性聚集、分离和回收再利用。利用固定化蛋白酶水解蛋白制备生物活性肽，能克服游离酶稳定性差、分离回收困难等缺点，因此磁性高分子微球在酶的固定化上得到广泛的应用研究[1-4]。

牛奶中蛋白质的质量分数为3.0%～3.5%，其中约80%为酪蛋白。酪蛋白含有全部蛋白质氨基酸，其中人体必需氨基酸含量丰富，有很高的营养价值，因此在食品工业和其它工业部门都得到了广泛的应用。但是酪蛋白在被消化吸收时在胃中易形成大凝块，影响人体（特别是婴、幼儿）对它的吸收利用。通过酶解酪蛋白的方法制备生物活性肽，既可以促进蛋白的消化吸收，又可以改善酪蛋白的生物活性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Alcalase(2.4 L，Novozymes)，N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷（WD51)，酪氨酸，酪蛋白，福林-酚试剂(自配)，水合茚三酮，可见紫外分光光度计(SP-755PC)，恒温振荡仪，冷冻干燥机(FDU-1100)，傅立叶红外，电镜等，其余试剂均为市售分析纯。

1.2 酶的固定化及酶活力测定

酶的固定化原理如图1所示。

NH4Fe(SO4)2·12H2O和(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O按照1.7∶1(Fe3+和Fe2+摩尔比)溶解在重蒸馏水中，加入PEG4000，使其浓度为10%。50℃恒温振荡20 min，再逐滴滴加浓度为3 mo1/L的NaOH溶液至pH值为5.5～5.7（Fe3O4等电点），然后50℃恒温振荡20 min，继续滴加浓度为3 mol/L的NaOH溶液至pH值为9.8，继续50℃恒温振荡5 h。即得到黑色水基Fe3O4磁流体。磁体吸附，洗涤后于4℃冰箱中保存。

10 g Na2SiO3·9H2O溶于100 mL重蒸馏水中，滴加Fe3O4，加入氨基化硅烷化试剂，再滴加质量分数为10%的(NH4)2SO4，50℃恒温振荡5 h，磁铁吸附，洗涤后于4℃冰箱中保存。

向氨基化的Fe3O4(Core)/SiO2(Shell)载体溶液中加戊二醛，使其质量分数为10%，50℃反应4 h，磁铁吸附，洗涤后冷冻干燥。取此载体加到稀释好的酶液中于4℃冰箱中反应一定时间完成酶的固定化。

酶活力测定采用福林-酚比色法[5]，此固定化酶的酶活力回收率=55%。

1.3 固定化酶水解酪蛋白

固定化酶经磁性分离并冷冻干燥后，根据比酶活称取一定酶活单位的此固定化酶，加入酪蛋白液中，超声10 s后，在恒温震荡仪中（130 r/min）进行固定化酶水解酪蛋白。

1.4 蛋白质质量分数测定

测定方法folin-酚/Lowry法[6-7]。

1.5 游离氨基数测定

采用水合茚三酮法[8]。

1.6 水解度计算及速率方程的定义[9]

式中：h为被裂解的肽键数；htot为原蛋白质中的总肽键数，这里的h和htot单位均为mmol/g表示。htot（酪蛋白）=8.2 mmol/g。

每一个肽键的断裂均会产生一个游离氨基，因此实验采用下面公式计算水解度：

式中：At为水解t小时后水解液中增加的游离氨基数，At单位为mmol/g。

实验中定义水解速率公式为

2 结果与讨论

2.1 透射电镜

图2(a)是Fe3O4透射电镜照片，可以看出制备的Fe3O4粒径较均匀，直径在20 nm左右，具有顺磁性。图2(b)是固定化酶之后的透射电镜照片，可以看出絮状的酶分子结合在载体上。

2.2 红外谱图分析

在红外灯下用溴化钾压片分别对不同固体样品进行红外分析，结果如图3所示。

由图3（a）可以看出，567.499cm-1是Fe3O4的特征吸收峰；由图3（b）可知，3436.43为Si-OH的伸缩振动吸收峰，1090.48出现的宽峰正是Si-O-Si的反对称伸缩特征吸收峰，958.595出现的包峰是Fe-O-Si的特征吸收峰，同时可以看到Fe3O4的特征吸收峰由原来的567.499移动到471.999，说明Fe3O4与SiO2之间不仅仅是简单的包被关系，而是形成了Fe-O-Si键；图3（c）中，在2927.31的CH2的对称伸缩振动吸收峰，3 400左右峰形增强变宽即N-H和O-H特征峰的重合出现，及在1 650～1 700出现的C=O伸缩振动吸收峰，都属于酶的特征吸收峰，说明酶与载体的结合。

2.3 时间对水解度的影响

图4为时间对水解度的影响。由图4可以看出，水解度先是随着水解时间而明显增加，当1 h后，水解度逐渐趋于平缓。分析纳米载体固定化酶水解蛋白质主要是受三方面影响：表面吸附现象；酶催化水解与酶催化合成的可逆性；酶的失活。一方面纳米微球增加了吸附表面积，另一方面短时间酶活的保持，使得最初短时间内水解度增加明显，可以看成一级动力学，而后随酶活的降低及水解可逆平衡的影响水解度逐渐呈现平缓趋势，不属于一级动力学。

2.4 表观动力学方程的建立

图4表明水解度与反应时间符合双曲线关系为

用1/DH对1/t做图，结果为线性关系如图5所示，其线性方程为

式（10）即为硅烷化磁性纳米微球固定化Alcalase酶水解酪蛋白的表观动力学方程。

并且采用不同初始底物酪蛋白浓度实验，如图6所示，均符合双曲线规律，并且斜率近乎相等。

3 结论

实验中利用具有柔性手臂的硅烷化纳米Fe3O4（核）/SiO2（壳）磁性高分子载体，以其优越的比表面积及在磁场中可分离的顺磁性，对Alcalase酶实现固定化，并对酪蛋白进行固定化酶水解。

研究结果表明：磁性纳米微球直径20 nm左右较均匀，具有顺磁性，核壳包被的硅烷试剂与Fe3O4之间形成了Fe-O-Si键，通过戊二醛完成了对Alcalase酶的固定化；用此固定化酶对酪蛋白进行水解，在优化了水解条件基础上主要讨论了其水解全过程的表观动力学模型。

[1]TORU M,NORIYUKI W,YUTAKA N,et al.Activity of an Enzyme Immo Bilized on Superpara Magneticparticles in a Rotational Magnetic Field[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,393(4):779-782.

[2]李鸿玉,厉重先,李祖明.磁性壳聚糖微球固定化果胶酶的研究[J].食品科学，2008(9):399-403.

[3]XIE W,MA N.Enzymatic Transesterification of Soybean oil by Using Immobilized Lipase on Mag netic Nano-Particles[J].Biomass and Bioenergy,2010,34(6):890-896.

[4]杨可可,杨婉身.硅烷化氨基磁性微球的制备及其固定化酶应用研究[J].四川农业大学学报,2008,26(2):135-140.

[5]YYSWDB0090.蛋白质含量测定福林酚法.中国分析网.http://www. analysis.org.cn.

[6]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2000：47-51.

[7]蛋白酶活力测定法.中华人民共和国专业标准.SB/T 10317～1999[S].

[8]张金桐,叶非.实验化学[M].北京：中国农业出版社,2010：206-208.

[9]赵新淮,冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定的研究[J].东北农业大学学报,1995.26（2）：178-181.

Research on immobilization of Alcalase on magnetic microsphere and establishment of casein hydrolysis kinetics model

XU Ying-cao,FENG Zhi-bao
（Department of Chemistry,College of Science,Northeast Agriculture University,Harbin 150030，China）

The objective of this paper was to study on immobilization of Alcalase on Fe3O4/SiO2(core/shell)magnetic nanoparticles,aminosilane reagent and glutaraldehyde as the cross-linking agent,electron microscopy and FTIR spectra as the characterization methods.The kinetics model of casein hydrolyzed by immobilized Alcalase was also studied,and established by hyperbolic kinetic equation.

immobilized Alcalase；magnetic microsphere；casein hydrolysate

Q816

A

1001-2230（2012）05-0024-03

2011-11-10

黑龙江省自然科学基金(D200804)。

徐英操（1977-），男，讲师，研究方向为食品科学与环境工程。

冯志彪