杨宁 蒋立新

有研究表明胆脂瘤的病理机制可能是细胞增殖与凋亡失衡的过程，并与多种细胞因子异常表达有关[1]。本研究通过观察凋亡抑制蛋白Livin及Survivin在胆脂瘤上皮的表达，探讨其与胆脂瘤的关系以及两者之间的相关性，从而进一步揭示中耳胆脂瘤的发病机制，为其治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1标本制备 选取符合纳入标准的25例中耳胆脂瘤标本为实验组，同时选取其中15例患者外耳道骨部正常皮肤组织为对照组。标本取出后，立即用10%甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片备用。

1.2检测试剂 Livin兔抗人多克隆抗体(即用型)购自武汉博士德生物技术有限公司，Survivin兔抗人多克隆抗体(即用型)、PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒、末端转移酶介导的原位缺口末端标记染色(TUNEL)凋亡细胞检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3检测方法

1.3.1PV-9000二步法免疫组织化学检测 标本经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化,3%过氧化氢溶液孵育10分钟, 蒸馏水洗涤5分钟2次，磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.3±0.1) 洗涤5分钟3次。微波炉抗原修复15 分钟(温度94～98 ℃), 蒸馏水洗涤5分钟2次,PBS洗涤5分钟3次。滴加一抗即用型Livin兔抗人多克隆抗体、Survivin兔抗人多克隆抗体，37 ℃湿盒孵育2小时，PBS冲洗3分钟3次。滴加二抗辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体，37 ℃湿盒孵育20分钟，PBS冲洗3分钟3次。加适当比例的DAB显色剂，显微镜下观察，显色3～5分钟，出现棕黄色颗粒后，以自来水充分冲洗终止显色,苏木素复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。用PBS溶液替代一抗作阴性对照，用已知的阳性片作阳性对照。

1.3.2TUNEL凋亡细胞的检测 切片常规脱蜡，充分水化后用新鲜配制的3%过氧化氢溶液孵育10 min,蒸馏水洗涤2分钟3次。标本片加0.01 M TBS(氯化钠8.5 g、Tris 1.2 g、纯乙酸0.5 ml、蒸馏水加至1 000 ml) 1：200新鲜稀释Proteinase K 37 ℃消化10分钟，0.01 M TBS 洗涤2分钟3次。标本片加标记缓冲液20微升/片，以保持切片湿润。每张切片取TdT和 DIG-UTP各1 μl，加入18 μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20微升/片。置样品于湿盒中，37 ℃反应2小时。0.01 M TBS 洗涤2分钟3次。加封闭液50微升/片，室温孵育30分钟，甩掉封闭液，不洗。用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体(取1 ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10 μl)，混匀后50微升/片加至标本上。置样品于湿盒中，37 ℃反应30分钟,0.01 M TBS洗涤2分钟3次。用抗体稀释液1：100稀释SABC：取1 ml抗体稀释液加SABC 10 μl，混匀后50微升/片加至切片,37 ℃反应30分钟,0.01 M TBS洗涤5分钟4次。DAB显色,水洗,苏木素轻度复染,脱水，透明，封片,显微镜观察。整个操作参照TUNEL凋亡细胞检测试剂盒说明书进行,以TBS代替末端标记液作阴性对照，已知TUNEL阳性片作阳性对照。

1.4结果判定 显微镜下观察Livin及Survivin以细胞核或细胞浆着棕黄色者为表达阳性细胞。评分方法：着色范围以阳性细胞所占的平均百分数记分:无着色为0，小于20%为1，21%～50%为2，大于50%为3；着色强度依据深浅记分：无着色为0，浅着色为1，深着色为2。上述两项相加为着色程度积分：结果是0、1为阴性(-)，2为弱阳性(+)，3为阳性(++)，大于等于4为强阳性(+++)。

凋亡判定：凋亡细胞阳性结果表现为棕黄色核、核固缩、核形状不规则，细胞核染色质浓缩、边聚，附着于核膜内表面，并形成新月形或环状,核碎裂。细胞凋亡程度以凋亡指数(apoptotic index,AI)表示。随机选取高倍视野,观察计数1 000个细胞，计算阳性细胞百分率，AI=阳性细胞数/观察细胞数×100%。

1.5统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计数资料用阳性例数和阳性率来表示，胆脂瘤上皮和胆脂瘤患者外耳道上皮之间表达阳性率的比较用四格表χ2检验，凋亡指数(AI)的比较采用t检验，相关分析采用Spearman等级相关检验，一致性检验采用Kappa分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Livin在胆脂瘤上皮中的表达 Livin在正常外耳道皮肤主要分布在基底层细胞的细胞质中(图1)，阳性9例，占60.0%。Livin在胆脂瘤上皮中不表达或低表达(图2)，阳性表达为5例，占20.0%，4例呈(+)，1例呈(++)，与正常皮肤组织阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=6.593，P=0.010)，胆脂瘤上皮中的Livin蛋白表达明显下调(表1)。

表1 实验组和对照组Livin蛋白的表达(例)

注:* 与对照组比较，χ2=6.593，P<0.05

2.2Survivin在中耳胆脂瘤上皮中的表达 15例正常外耳道皮肤标本中10例可见到Survivin蛋白的阳性表达(图3)，25例胆脂瘤标本中有7例Survivin阳性表达，着色于胆脂瘤上皮的基底层和基底上层细胞的细胞核和/或细胞质(图4)。阴性对照胆脂瘤上皮未见Survivin蛋白表达。两组阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=5.736，P=0.017)，Survivin在胆脂瘤上皮的表达明显下调(表2)。

表2 实验组和对照组Survivin蛋白的表达(例)

注:* 与对照组比较，χ2=5.736，P<0.05

2.3中耳胆脂瘤组织中Survivin 和Livin蛋白表达的相关性(表3)

表3 中耳胆脂瘤组织中Survivin和Livin蛋白表达的相关性(例)

经Spearman等级相关检验，r=0.749，P=0.000，Kappa值为0.688，P=0.000，两因子呈正相关，一致性较好，说明它们可能起协同作用。

2.4凋亡细胞检测 全部标本都存在凋亡细胞，但阳性细胞数量及分布部位不同。在正常外耳道皮肤中，凋亡细胞散在分布于上皮各层中，数量较少(图5)，AI均值为 3.20%±0.90%；胆脂瘤上皮中，凋亡细胞分布于颗粒层和棘层(图6)，AI值明显升高，平均为43.80%±12.60%，两组差异有显著统计学意义(t=2.797，P=0.01)。

图1 Livin在外耳道皮肤的阳性表达(二步法×200)图2 Livin在胆脂瘤上皮的阴性表达(二步法×200) 图3 Survivin在外耳道皮肤的阳性表达(二步法×200)

2.5胆脂瘤组织中凋亡抑制蛋白的表达与细胞凋亡的关系 胆脂瘤组织中凋亡抑制蛋白Livin、Survivin表达阴性组AI值明显升高，分别为82.50%±8.30%和75.20%±10.70%，Livin、Survivin表达阳性组AI值较低，分别为21.70%±2.60%和35.50%±6.70%，经Spearman 等级相关检验，两者呈负相关。

3 讨论

中耳胆脂瘤的特点是上皮细胞有高度增殖能力，但细胞增殖旺盛的同时，细胞的凋亡也加速[1]。Sasaki等[2]认为胆脂瘤属于局部增殖性疾病。 Bujia等[3]比较胆脂瘤上皮和外耳道上皮的增殖细胞核抗原(proliforating cell nuclear antigen,PCNA)的表达差异，胆脂瘤上皮各层细胞都有PCNA的表达，说明胆脂瘤上皮细胞有潜在的分裂增殖能力。Park等[4]用TUNEL法、免疫印迹和免疫组织化学法检测发现，与凋亡相关的Fas/APO-1蛋白在胆脂瘤上皮棘层和颗粒层细胞中表达增强；Kojima等[5]用原位杂交和免疫组织化学法分别检测凋亡细胞和PCNA，发现胆脂瘤上皮各层细胞均有PCNA表达，提示胆脂瘤上皮具有高度增生和凋亡的双重特性。

TUNEL技术在保持组织细胞形态的基础上观察凋亡细胞的分布，其特异性和敏感性都很高。本研究发现，在正常外耳道皮肤中，凋亡细胞散在分布于上皮各层中，数量较少；而在胆脂瘤上皮中，凋亡细胞分布于颗粒层和棘层，数量较多，显著高于正常外耳道上皮组织，证实胆脂瘤上皮细胞中确实存在凋亡增强。在正常鳞状上皮中，只有基底层的细胞具有分裂能力，随后细胞离开此层向上皮表面迁移，当细胞到达颗粒层的时候，进入破坏期，失去细胞器，最终胞浆内只残余角蛋白丝，这是正常鳞状上皮的凋亡过程[6]。因而凋亡细胞应表达在颗粒层，胆脂瘤上皮凋亡细胞不仅出现在颗粒层，而且出现在棘层，表明胆脂瘤上皮棘层细胞即开始了凋亡过程，这可能是胆脂瘤上皮细胞凋亡增强的组织学基础。这种胆脂瘤上皮的棘层细胞中一部分细胞仍具有分裂能力、另一部分细胞则开始了凋亡过程的现象，说明胆脂瘤上皮细胞增殖和凋亡发生了紊乱，即上皮过度增殖产生了大量细胞，同时又发生相应的凋亡增强，周而复始，促进了胆脂瘤角蛋白碎屑堆积，使胆脂瘤不断增大[7]。

Livin是近年来发现的人类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员，最初从人类胚肾cDNA克隆得到，称为K IAP(kidney inhibitor of apoptosis protein)[8]。由于该基因在黑色素瘤细胞中高度表达，也叫做ML IAP(melanoma inhibitor of apoptosis protein)[8]。Livin蛋白N端包含一个BIR结构，C端含有一个RING环指结构，抗凋亡的主要结构为BIR。Livin在正常成人大多数终末分化组织中低表达或不表达，但在黑色素瘤、肺癌、胃肠癌、膀胱癌、乳腺癌等多种人类肿瘤中表达[8～12]。最近研究表明，Livin可以抑制内源性和外源性两条途径诱导的细胞凋亡。另外，Livin还可以直接抑制Caspase而实现抗细胞凋亡。Livin通过两个亚基的BIR序列与Caspase-3、6、7、8、9、10结合而发挥抗细胞凋亡作用。越来越多的研究表明，Livin在肿瘤的发生、发展中起重要的作用[8～12]。已有实验表明，Livin能够抑制多种刺激(包括抗癌药)诱导的肿瘤细胞的凋亡，并与肿瘤细胞的耐药性有关[13]。Survivin也是IAP家庭成员之一。最近Park[14]等研究证实在胆脂瘤上皮中可以检测到P63与Survivin蛋白的表达，且Survivin蛋白的表达与细胞凋亡呈负相关，Huisma[15]的研究也证实了这一点。本研究检测到Livin在胆脂瘤上皮中不表达或低表达，阳性表达率显著低于正常外耳道皮肤，说明胆脂瘤中的Livin蛋白表达明显下调；胆脂瘤标本中Survivin蛋白的阳性表达率也低于正常外耳道皮肤，说明Survivin在胆脂瘤上皮的表达也明显下调。

Survivin和Livin同属于IAP家族成员，均可直接作用于Caspase-3和Caspase-7，实现抗细胞凋亡作用，但是二者在抗凋亡功能上并非完全一样，它们之间是否存在相关性，目前报道甚少。本研究采用Spearman等级相关检验得出，两因子呈正相关，一致性较好，说明它们可能在胆脂瘤的发生、发展中起协同作用。胆脂瘤组织中凋亡抑制蛋白Livin、Survivin表达阴性组，AI值明显升高，Livin、Survivin表达阳性组AI值较低，经Spearman等级相关检验两者呈负相关，即凋亡抑制蛋白表达越高，细胞凋亡越少；凋亡抑制蛋白表达越低，细胞凋亡越多。

本研究检测了Survivin、Livin在正常外耳道皮肤与中耳胆脂瘤组织中的表达情况，并探讨了二者与胆脂瘤发生、发展的关系以及二者表达的相关性，进一步证明胆脂瘤上皮存在过度凋亡，为进一步揭示中耳胆脂瘤的发病机理提供了实验依据，同时为它的靶向治疗提供了新的途径。

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