杨宁 蒋立新

有研究表明胆脂瘤的病理机制可能是细胞增殖与凋亡失衡的过程，并与多种细胞因子异常表达有关[1]。本研究通过观察凋亡抑制蛋白Livin及Survivin在胆脂瘤上皮的表达，探讨其与胆脂瘤的关系以及两者之间的相关性，从而进一步揭示中耳胆脂瘤的发病机制，为其治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1标本制备 选取符合纳入标准的25例中耳胆脂瘤标本为实验组，同时选取其中15例患者外耳道骨部正常皮肤组织为对照组。标本取出后，立即用10%甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片备用。

1.2检测试剂 Livin兔抗人多克隆抗体(即用型)购自武汉博士德生物技术有限公司，Survivin兔抗人多克隆抗体(即用型)、PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒、末端转移酶介导的原位缺口末端标记染色(TUNEL)凋亡细胞检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3检测方法

1.3.1PV-9000二步法免疫组织化学检测 标本经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化,3%过氧化氢溶液孵育10分钟, 蒸馏水洗涤5分钟2次，磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.3±0.1) 洗涤5分钟3次。微波炉抗原修复15 分钟(温度94～98 ℃), 蒸馏水洗涤5分钟2次,PBS洗涤5分钟3次。滴加一抗即用型Livin兔抗人多克隆抗体、Survivin兔抗人多克隆抗体，37 ℃湿盒孵育2小时，PBS冲洗3分钟3次。滴加二抗辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体，37 ℃湿盒孵育20分钟，PBS冲洗3分钟3次。加适当比例的DAB显色剂，显微镜下观察，显色3～5分钟，出现棕黄色颗粒后，以自来水充分冲洗终止显色,苏木素复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。……