钟继红 刘勇攀 陈丹丹 黄秋薇 张馨瑞 徐勤科 叶露

[摘要] 目的 研究雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）對葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）小鼠结肠黏膜损伤的影响及调控机制。方法 将40只小鼠采用随机数字表法分为正常组，模型组，雷公藤多苷低、中、高剂量组（给药浓度分别为9.00、27.03、81.09mg/kg）。除正常组外，其余组小鼠均饮用5% DSS诱导UC模型。造模后，模型组小鼠予生理盐水灌胃，其余处理组小鼠予相应剂量的TG灌胃。比较各组小鼠的质量、疾病活动指数（disease activity index，DAI）、结肠病理组织学损伤情况。使用肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒检测TNF-α、MDA、SOD水平差异。Western blot法检测结肠中Nur77、TNF受体关联因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，Traf2）、核孔蛋白62（nucleoporin 62，P62）、自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3（autophagy protein-microtubule associated protein1 light chain 3，LC3）分子表达。结果 与空白组相比，模型组小鼠的体质量、结肠长度、SOD、Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低（P<0.05），DAI、结肠病理评分、TNF-α、MDA、P62水平升高（P<0.05）。与模型组相比，雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠体质量、结肠长度、SOD、Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达增长（P<0.05），DAI、TNF-α、MDA、P62水平均降低（P<0.05）。雷公藤多苷中、高剂量组小鼠病理评分降低（P<0.05）。结论 TG能够通过Nur77-Traf2-P62信号通路治疗UC。

[关键词] 雷公藤多苷；溃疡性结肠炎；Nur77-Traf2-P62信号通路；自噬

[中图分类号] R574      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.11.014

Mechanistic study of tripterygium glycosides in the treatment of ulcerative colitis through the Nur77-Traf2-P62 signaling pathway

ZHONG Jihong1， LIU Yongpan1， CHEN Dandan2， HUANG Qiuwei2， ZHANG Xinrui2， XU Qinke2， YE Lu2

1.Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， Zhejiang， China; 2.the Second Clinical Medical College， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigated the effect of tripterygium glycosides （TG） on dextran sodium sulfate （DSS）-induced colonic mucosal damage in ulcerative colitis （UC） mice and its regulatory mechanism. Methods Forty C57BL/6J mice were randomly divided into a normal group， a model group， and a tretinoin low， medium， and high dose group （administered at concentrations of 9.00mg/kg， 27.03mg/kg， and 81.09mg/kg， respectively）. The mice in the normal group were free to drink distilled water， and the rest of the mice drank 5% DSS to induce UC modeling. After modeling， mice in the model group were given 0.4ml of saline by gavage daily， and the rest of the mice in the treatment group were given the corresponding dose of TG for gavage intervention. The mass and disease activity index of the mice in each group were compared， and the pathological and histological damage of the colon was observed. Tumor necrosis factor-α （TNF-α）， malondialdehyde （MDA）， and superoxide dismutase （SOD） levels were measured using the corresponding kits. Western blot Detection of Nur77， tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 （Traf2）， nucleoporin 62 （P62）， autophagy protein-microtubule associated protein1 light chain 3 （LC3） molecular expression. Results Compared with the blank group， the body weight， colon length， SOD， Nur77， Traf2， and LC3II/LC3Ⅰ levels of mice in the model group were significantly decreased （P<0.05）， and the DAI level， colon pathology score， TNF-α， MDA level， and P62 of the mice were significantly increased （P<0.05）. Compared with mice in the UC model group， mice in the low， medium and high dose groups of tretinoin polyphenols showed significant increases in body weight， colon length， SOD， Nur77， Traf2， LC3II/LC3Ⅰlevels （P<0.05）， and mice with DAI scores， TNF-α， MDA levels in the colon， and P62 levels were significantly decreased （P<0.05）. Mice in the medium and high dose groups of tretinoin polyphenols pathological scores were significantly reduced （P<0.05）. Conclusion TG is able to treat ulcerative colitis through Nur77-Traf2-P62 signaling pathway.

[Key words] Tripterygium glycosides; Ulcerative colitis; Nur77-Traf2-P62 signaling pathway; Autophagy

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种免疫介导的大肠慢性、炎症性疾病，其患病率和发病率逐年升高。UC不仅可以出现腹痛、黏液脓血便等症状，长期发展可引起发育不良或者结直肠癌[1]。此外，该病患者可能合并焦虑等心理疾病，严重影响患者的生活质量及长期发展[2]。遗传易感性、上皮屏障破坏和肠道菌群失调会引发免疫反应失调和异常炎症信号，导致UC的发生。但是目前UC的发病原因及机制仍不明确，深入探索UC的确切发病机制和寻找有效的治疗药物是迫切需要解决的问题。研究表明，线粒体功能缺陷在UC发病中起到重要作用，炎症性肠病患者的结肠中的线粒体形态改变、膜电位降低、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增加，线粒体自噬机制遭到破坏[3-4]。雷公藤是卫矛科植物雷公藤的根茎，具有祛风除湿、通络止痛、解毒杀虫等功效[5]。雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）提取自草药雷公藤中，主要成分为雷公藤红素和雷公藤甲素，具有免疫调节、抗炎、抗感染等药理作用[6]。在临床中，TG常用于类风湿性关节炎等免疫疾病的治疗。相关药理研究发现，TG可在多种疾病中发挥抗炎及调节自噬作用[7-9]。有实验研究发现，雷公藤红素可通过Nur77与TNF受体关联因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，Traf2）相互作用的方式诱导线粒体自噬，进而抑制炎症[10]。本研究采用葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）构造UC动物模型，观察TG对UC小鼠及Nur77、Traf2、核孔蛋白62（nucleoporin 62，P62）的影响，探寻其治疗UC的可能作用机制，为UC患者的治疗提供一个新的治疗靶点。

1  材料与方法

1.1  实验动物

6～8周龄的SPF级C57BL/6J小鼠40只，体质量20～24g，购自上海斯莱克动物实验有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004]。饲养于浙江中医药大学动物中心[实验动物使用许可证号SYXY（浙）2021-0012]。本研究得到浙江中医药大学动物保护与伦理委员会批准（伦理审批号：20210726-08）。

1.2  主要材料

DSS购自美国MP公司；雷公藤多苷片购自浙江得恩德制药有限公司；小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒购于上海梵凯实业有限公司；组织细胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、组织细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒（WST-8法）购自北京普利莱公司；Nur77多克隆抗体、P62多克隆抗体、Traf2多克隆抗体购自美国ImmunoWay公司；β-肌动蛋白兔单克隆抗体、山羊抗兔辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗购自浙江达文有限公司；自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3（autophagy Protein- microtubule associated protein1 light chain 3，LC3）多克隆抗体购自英国Abcam公司。

1.3  动物实验分组及模型制备

40只小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法将其随机分为5组（8只/组）。除正常组小鼠外，其余小鼠均自由饮用7d 5%DSS诱导UC模型。造模后，模型组小鼠每日予0.4ml生理盐水灌胃；低、中、高剂量组小鼠分别予9.00mg/kg、27.03mg/kg、81.09mg/kg浓度的雷公藤多苷混悬液0.4ml灌胃。共灌胃7d，每天观察小鼠的体质量变化和疾病活动指数（disease activity index，DAI）。

1.4  HE染色觀察结肠病理学改变

将小鼠结肠组织固定于4%多聚甲醛组织固定液24h，取病变最明显处，将其包埋、切片、HE染色后，置于光镜下观察组织结构及形态改变。

1.5  检测方法

取冻存的小鼠结肠组织，按照试剂盒的说明书进行操作，检测结肠组织中TNF-α、SOD、MDA的含量。将冻存的结肠组织进行裂解，取上清液为总蛋白，采用BCA定量后进行Western blot法检测。使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，100V电压，电泳2h。电泳结束后，在300mA电流下转模1h并使用5% BSA封闭2h。然后将膜取出，使用TBST漂洗后，分别置于β-actin、Nur77、P62、Traf2、LC3一抗中4℃孵育过夜。隔日回收一抗，将膜再次使用TBST漂洗，然后加入二抗在室温下孵育1h，再次洗膜后滴加ECL显影液进行压片显影。以β-actin为内参，采用Image J软件对图像中条带的灰度值进行相对定量计算。

1.6  统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行处理分析，若数据符合正态分布，计量数据以均数±标准差（）表示，且多组间方差齐则采用方差分析，组间比较采用LSD-t法分析，若数据不符合正态分布采用中位数（四分位间距）[M（Q1，Q3）]表示。采用Kruskal-Wallis H检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  小鼠结肠长度、体质量、DAI评分及病理学评分

实验期间，正常组小鼠精神状态正常，毛色光泽，粪便正常，体质量呈自然上升趋势。模型组小鼠精神状态萎靡，毛色及眼神暗淡，粪便呈血稀便，体质量呈逐渐下降趋势。TG干预的三组小鼠的症状较模型组小鼠改善，以雷公藤多苷高剂量组小鼠改善最明显。

实验结束后，与正常组比较，模型组小鼠体质量显著降低，DAI评分显著升高，病理学评分显著上升，结肠长度明显减短，差异均有统计意义（P<0.05）。与模型组小鼠比较，雷公藤多苷给药后小鼠结肠均增长，体质量增加，DAI评分降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。TG给药后小鼠结肠病理评分均下降，其中雷公藤多苷中、高剂量组小鼠与模型组比具有显著差异（P<0.05）。

2.2  各组小鼠TNF-α、SOD、MDA含量

实验结束后，与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中TNF-α、MDA含量显著增加，SOD含量显著下降。与模型组小鼠相比，TG给药后小鼠结肠中TNF-α、MDA含量显著降低，TG给药后小鼠结肠中SOD含量均增加，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3  小鼠通路相关蛋白及自噬蛋白表达情况

实验结束后，与正常组相比，模型组小鼠结肠组织中Nur77、Traf2蛋白表达水平显著降低，P62蛋白表达水平显著上升；此外LC3Ⅱ/LC3Ⅰ自噬蛋白水平显著降低（P<0.05）。与模型组小鼠相比，TG给药后小鼠结肠中Nur77、Traf2蛋白水平均显著上调，中、高剂量组小鼠结肠中P62蛋白水平下调，此外所有给药小鼠结肠中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ自噬蛋白水平显著上调（P<0.05）。

3  讨论

UC是一种与溃疡形成和复发性炎症相关的结肠炎症性疾病，它发病的确切机制仍然不清楚。目前，临床上治疗UC的药物，主要有糖皮质激素、氨基水杨酸制剂和生物抑制剂。但是由于其诱发的严重不良反应和低临床应答率，临床上迫切需要开发一种疗效更好、不良反应更小的新治疗策略来治疗UC。尽管UC的发病原因尚不明确，但是目前认为线粒体功能缺陷在UC发病中起到重要作用。线粒体是细胞内重要的供能细胞器，同时可产生ROS从而调节氧化还原信号传导通路。研究表明，UC发病过程中炎症小体激活与线粒体源ROS密切相关[11-12]。线粒体源ROS在炎症反应中作为重要介质发挥驱动炎症反应的作用。MDA是ROS诱导的脂质过氧化的最终产物之一，可引发细胞代谢和功能障碍，导致细胞死亡，而SOD等抗氧化酶可以预防ROS对组织造成损伤[13-14]。促炎细胞因子和氧化应激的过度产生是UC发病过程中结肠损伤的重要标志物[15]。在线粒体受损后，ROS的过度产生进一步促进促炎细胞因子释放，放大免疫信号并破坏肠黏膜屏障[16-18]。因此，线粒体受损后的功能异常与UC的发病密切相关。本研究DSS诱导的UC小鼠模型中，小鼠体质量下降，DAI评分增高，结肠长度缩短，结肠中TNF-α、MDA含量升高，SOD含量下降。经TG干预后，小鼠体质量上升，DAI评分降低，结肠长度变长，结肠中TNF-α、MDA含量降低，SOD含量显著上调。结果表明，TG可减轻DSS诱导的结肠炎症，并减少UC小鼠促炎细胞因子的产生和氧化应激，其机制可能与线粒体自噬有关。

Nur77是一种核受体转录因子，在肝炎、炎症性肠病等炎症性疾病的发病过程中发挥着核心作用。近年来发现的Nur77-Traf2-P62通路是一条参与炎症反应和细胞自噬的信号通路，该通路参与多种疾病的病理生理过程，包括炎症和肿瘤，激活该通路可有助于促进自噬并抑制炎症反应[10，19]。Bauer等[20]研究发现，Nur77在DSS诱导的UC模型中是肠道炎症产生的关键，因此Nur77可成为治疗UC的潜在靶点。Zhang等[4]的研究發现，Nur77从细胞核转运至细胞质，转而并定位于线粒体，从而诱导细胞凋亡。当Nur77从核内转运到线粒体上时，会与Traf2相互作用。Traf2是一种重要的炎症信号通路支架蛋白和关键的泛素连接酶。在炎症状态下，泛素化的Nur77在线粒体上与P62泛素结合域相互作用，从而增强线粒体自噬的敏感性。在细胞自噬过程中，自噬发生的核心蛋白LC3与修饰后的Nur77发生特异的相互作用，确保受损线粒体的选择性清除，细胞将受损的线粒体包裹成自噬小体，并将其输送到溶酶体中完成自噬过程。本研究发现，在DSS诱导的UC小鼠模型中，小鼠结肠中Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达降低，P62表达上升。经TG干预后，小鼠结肠中Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达上调，P62表达降低。实验结果表明TG可通过激活Nur77-Traf2-P62信号通路缓解DSS诱导的结肠炎症，而这一过程可能与线粒体自噬有关。

综上所述，TG可以改善DSS诱导的UC小鼠的结肠炎症及氧化应激，其机制可能与激活Nur77-Traf2-P62通路促进自噬有关。本研究从自噬角度初步解释了TG改善UC的作用机制，为临床治疗UC提供了一定依据，但仍需开展深入的分析研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] NAKASE H， UCHINO M， SHINZAKI S， et al. Evidence- based clinical practice guidelines for inflammatory bowel disease 2020[J]. J Gastroenterol， 2021， 56（6）： 489–526.

[2] RUBIN D T， ANANTHAKRISHNAN A N， SIEGEL C A， et al. ACG Clinical Guideline： Ulcerative colitis in adults[J]. Am J Gastroenterol， 2019， 114（3）： 384–413.

[3] KABI A， NICKERSON K P， HOMER C R， et al. Digesting the genetics of inflammatory bowel disease： insights from studies of autophagy risk genes[J]. Inflamm Bowel Dis， 2012， 18（4）： 782–792.

[4] ZHANG H， ZHENG L， MCGOVERN D P， et al. Myeloid ATG16L1 facilitates Host-Bacteria interactions in maintaining intestinal homeostasis[J]. J Immunol， 2017， 198（5）： 2133–2146.

[5] 許林帅， 常岑， 时一鸣， 等. 雷公藤及其有效成分治疗类风湿性关节炎的研究进展[J]. 上海中医药杂志， 2023， 57（5）： 91–95.

[6] 林娜， 姜泉， 刘维， 等. 雷公藤多苷/雷公藤片治疗类风湿关节炎用药指南[J]. 中国中药杂志， 2020， 45（17）： 4149–4153.

[7] CHEN W Q， WANG B， DING C F， et al. In vivo and in vitro protective effects of the Wuzi Yanzong pill against experimental spermatogenesis disorder by promoting germ cell proliferation and suppressing apoptosis[J]. J Ethnopharmacol， 2021， 280： 114443.

[8] XIE C， JIANG J， LIU J， et al. Triptolide suppresses human synoviocyte MH7A cells mobility and maintains redox balance by inhibiting autophagy[J]. Biomed Pharmacother， 2019， 115： 108911.

[9] WANG X， ZHANG Y， DING Z， et al. Cross-talk between the RAS-ERK and mTOR signalings-associated autophagy contributes to tripterygium glycosides tablet- induced liver injury[J]. Biomed Pharmacother， 2023， 160： 114325.

[10] HU M， LUO Q， ALITONGBIEKE G， et al. Celastrol- induced Nur77 interaction with TRAF2 alleviates inflammation by promoting mitochondrial ubiquitination and autophagy[J]. Mol Cell， 2017， 66（1）： 141–153.

[11] LIOCHEV S I. Reactive oxygen species and the free radical theory of aging[J]. Free Radic Biol Med， 2013， 60： 1–4.

[12] ZHOU R， YAZDI A S， MENU P， et al. A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation[J]. Nature， 2011， 469（7329）： 221–225.

[13] EL-AKABAWY G， EL-SHERIF N M. Zeaxanthin exerts protective effects on acetic acid-induced colitis in rats via modulation of pro-inflammatory cytokines and oxidative stress[J]. Biomed Pharmacother， 2019， 111： 841–851.

[14] JEON Y D， LEE J H， LEE Y M， et al. Puerarin inhibits inflammation and oxidative stress in dextran sulfate sodium-induced colitis mice model[J]. Biomed Pharmacother， 2020， 124： 109847.

[15] WANG R， LUO Y， LU Y， et al. Maggot extracts alleviate inflammation and oxidative stress in acute experimental colitis via the activation of Nrf2[J]. Oxid Med Cell Longev， 2019， 2019： 4703253.

[16] EISENSTEIN M. Gut reaction[J]. Nature， 2018， 563（7730）： 34–35.

[17] KUMAR S， SUMAN S， FORNACE A J， et al. Intestinal stem cells acquire premature senescence and senescence associated secretory phenotype concurrent with persistent DNA damage after heavy ion radiation in mice[J]. Aging （Albany N Y）， 2019， 11（12）： 4145–4158.

[18] MARTIN J C， CHANG C， BOSCHETTI G， et al. Single-cell analysis of crohns disease lesions identifies a pathogenic cellular module associated with resistance to anti-TNF therapy[J]. Cell， 2019， 178（6）： 1493–1508.

[19] DENG Z， LIU Q， WANG M， et al. GPA peptide- induced Nur77 localization at mitochondria inhibits inflammation and oxidative stress through activating autophagy in the intestine[J]. Oxid Med Cell Longev， 2020， 2020： 4964202.

[20] BAUER C， DUEWELL P， MAYER C， et al. Colitis induced in mice with dextran sulfate sodium （DSS） is mediated by the NLRP3 inflammasome[J]. Gut， 2010， 59（9）： 1192–1199.

（收稿日期：2023–06–16）

（修回日期：2024–02–18）