陈国斌 祝文峰 史文娟 董倩

宫腔粘连 (intrauterine adhesion,IUA) 是最常见的子宫内膜病变疾病之一［1］。近年来,由于子宫内膜损伤和感染的增加,IUA 的发病率有所上升［2］。目前尽管经宫腔镜下宫腔粘连分离术是IUA 的标准治疗方法,但治疗后复发率仍较高［3］。IUA 与继发性不孕和流产密切相关,是目前影响女性生殖健康的重要病因之一［4］,因此研究IUA 的发病机制对于IUA 的防治具有重要的意义。相关研究表明,子宫内膜纤维化是IUA 最重要的病理特征之一［5］。基质细胞作为子宫内膜的主要细胞群之一,是子宫内膜功能的重要介质,因此,探究IUA 子宫内膜基质细胞纤维化相应的分子机制具有重要的意义。同源框转录反义RNA (homeobox gene antisense intergenic RNA,HOTAIR)是一种与多种纤维化疾病相关的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),已有研究报道,过表达HOTAIR 可促进子宫内膜纤维化［6］,但具体分子机制尚不完全明确。lncRNA 通过海绵化miRNA 来调控mRNA 表达是其发挥其作用的方式之一［7］。本研究通过生物信息学分析发 现,HOTAIR 与miR-326、miR-326 与NUS1 存 在结合位点。相关文献报道,miR-326 在IUA 子宫内膜组织中下调表达,过表达miR-326 通过下调促纤维化基因来抑制子宫内膜纤维化［8］；NUS1 在IUA 组织中上调,且其高表达与IUA 的严重程度呈正相关［9］。而HOTAIR 能否通过调控miR-326/NUS1 轴影响IUA 子宫内膜基质细胞纤维化尚不明确。因此,本研究主要探究HOTAIR 对IUA 子宫内膜基质细胞纤维化的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 收集2018 年2 月～2020 年2 月在本院首次确诊为IUA 的18 例患者的子宫内膜组织,另取同期因不孕症接受宫腔镜子宫内膜活检的18 例患者的子宫内膜组织作为对照。本研究得到本院伦理委员会审核批准,术前获得所有患者的书面知情同意书。HESC 细胞购自上海弘顺生物公司。

1.2主要试剂 HOTAIR 小干扰RNA(si-HOTAIR)及其阴性对照(si-NC)、HOTAIR 过表达物(pIRES2-HOTAIR) 及其阴 性对照(pIRES2)、miR-326 模拟物(miR-326 mimic)及其阴性对照(mimic NC)均购自上海美轩生物公司；CCK-8 试剂盒购自上海广锐生物公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒购自上海富雨生物公司；兔源-抗纤连蛋白(Fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原蛋 白α1 链(collagen type 1 α1 chain,COL1A1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NUS1、GAPDH 及过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗均购自英国Abcam 公司。

1.3细胞培养及分组 将HESC 细胞置于含有10%胎牛血 清、100 U/ml 青霉素 和100 μg/ml 链 霉素的DMEM-F12 培养基中,并在37℃、5% CO2条件下培养。将HESC 细胞用10 ng/ml TGF-β1处理48 h［2］以诱导IUA 子宫内膜基质细胞模型,命名为IUA HESC细 胞。将IUA HESC 细胞分 为Ct 组(TGF-β1处 理HESC 细 胞48 h)、pcDNA 组(转 染pcDNA 24 h 后 再用TGF-β1处 理HESC 细 胞48 h)、pcDNA-HOTAIR组(转 染pcDNA -HOTAIR 24 h 后再用TGF-β1处理HESC 细胞48 h)、si-NC 组(转染si-NC 24 h 后再用TGF-β1处理HESC 细胞48 h)、si-HOTAIR 组(转染si-HOTAIR 24 h 后 再用TGF-β1处 理HESC 细 胞48 h)、si-HOTAIR+inhibitor NC 组(转 染si-HOTAIR+inhibitor NC 24 h 后再用TGF-β1处理HESC 细胞48 h)、si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 组(转染si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 24 h 后再用TGF-β1处理HESC 细胞48 h)。

1.4qRT-PCR 检测组织和细胞中HOTAIR、miR-326 表达 使用TRIzol 试剂从组织匀浆和细胞中提取总RNA。将总RNA(2 μg)逆转录为 cDNA 后,以cDNA为模板进行定量聚合酶链式反应(PCR)。GAPDH 作为HOTAIR 的内参基因,U6 作为miRNA 的内源性对照,采用2-ΔΔCt法计算基因的表达量。引物序列：GAPDH：正向为5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'；反向为5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；HOTAIR：正向为5'-CCTTATAAGCTCATCGGAGCA-3'；反向为5'-C ATTTCTGGGTGGTTCCTTT-3'；miR-326：正向为5'-C CTCTGGGCCCTTCC-3'；反向为5'-CAGTGCGTGTCGT GGAGT-3'；U6：正向为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5CCK-8 法检测IUA HESC 细胞增殖 将各组细胞以2×104个/孔的密度接种在96 孔板中,孵育48 h 后每孔加入10 μl CCK8 试剂。使用SpectraMax M5 酶标仪检测OD450。

1.6流式细胞术检测IUA HESC 细胞凋亡 将各组细胞用PBS 洗涤后调整细胞浓度为5×104个/ml,加入5 μl Annexin-V-FITC 和 5 μl PI 在4 ℃下避光孵育20 min 后,再用500 μl 结合缓冲液重悬细胞。通过流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.7western blot 检测组织和细胞中NUS1、COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表达 在冰上使用RIPA 裂解缓冲液从组织匀浆和细胞中提取总蛋白。将获得的裂解物在4℃下以12000×g 离心30 min。通过使用BCA 蛋白质测定试剂盒进行蛋白质定量。蛋白质通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移到PVDF 膜上。用5%脱脂奶粉封闭后,将膜与一抗NUS1(1∶1000)、COL1A1(1∶2000)、FN(1∶1000)、α-SMA(1∶2000)、GAPDH(1∶1000)在 4℃下孵育过夜,然后将膜与二抗(1∶1000)在室温下孵育2 h。使用ChemiDoc MP 成像系统检测条带,并使用ImageJ 1.51软件对所有蛋白质条带进行定量分析。

1.8双荧光素酶报告基因实验 构建HOTAIR-WT 和HOTAIR-MUT,将HOTAIR-WT 和HOTAIR-MUT 分别与mimic NC 或miR-326 mimic 共转染于IUA HESC 细胞,48 h 后检测荧光素酶活性。

1.9RNA pull down实验 对pIRES2-HOTAIR或pIRES2的DNA 片段进行PCR 扩增、酶切后,得到线性化的质粒DNA。使用生物素RNA 标记线性化的pIRES2-HOTAIR 和pIRES2,分别命名为bio-HOTAIR、bio-NC。将bio-HOTAIR、bio-NC 在体外转录、纯化后,将其分别与IUA HESC 细胞的总细胞裂解物一起孵育,洗脱的RNA 被纯化并通过qRT-PCR 评估HOTAIR、miR-326 的表达量。

1.10统计学方法 使用IBM SPSS Statistics 24.0 软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差()表示,两组间比较采用t 检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两组间的比较采用SNK-q 检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在组织和细胞中的表达 IUA 子宫内膜组织中 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表达水平高于正常子宫内膜组织,miR-326 表达水平低于正常子宫内膜组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1,表1。IUA HESC 细胞中 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表达水平高于HESC 细胞,miR-326 表达水平低于HESC 细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2,表2。

图1 western blot 检测组织中NUS1 蛋白表达

表1 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在组织中的表达(,n=18)

表1 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在组织中的表达(,n=18)

注：与正常子宫内膜组织比较,aP<0.05

图2 western blot 检测细胞中NUS1 蛋白表达

表2 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在细胞中的表达(,n=6)

表2 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在细胞中的表达(,n=6)

注：与HESC 细胞比较,aP<0.05

2.2HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC细胞中的表达 pcDNA-HOTAIR 组 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表达水平高于Ct 组、pcDNA 组,miR-326 表达水平低于Ct 组、pcDNA 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR 组 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表 达水平低于Ct 组、si-NC 组,miR-326 表达水平高于Ct 组、si-NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR组、si-HOTAIR+inhibitor NC 组 及si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 组 HOTAIR 表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 组miR-326 表达水平低于si-HOTAIR 组、si-HOTAIR+inhibitor NC 组,NUS1/GAPDH 表达水平高于si-HOTAIR 组、si-HOTAIR+inhibitor NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3,表3。

表3 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC 细胞中的表达(,n=6)

表3 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC 细胞中的表达(,n=6)

注：与Ct 组比较,aP<0.05；与pcDNA 组比较,bP<0.05；与si-NC 组比较,cP<0.05；与si-HOTAIR 组比较,dP<0.05；与si-HOTAIR+inhibitor NC 组比较,eP<0.05

图3 western blot 检测IUA HESC 细胞中NUS1 蛋白表达

2.3过表达或沉默HOTAIR 对IUA HESC 细胞增殖的影响 pcDNA-HOTAIR 组IUA HESC 细 胞OD450值高于Ct 组、pcDNA 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR 组IUA HESC 细胞OD450值低于Ct 组、si-NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 组IUA HESC 细胞OD450值高于si-HOTAIR 组、si-HOTAIR+inhibitor NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 七组IUA HESC 细胞OD450 值比较(,n=6)

表4 七组IUA HESC 细胞OD450 值比较(,n=6)

注：与Ct 组比较,aP<0.05；与pcDNA 组比较,bP<0.05；与si-NC 组比较,cP<0.05；与si-HOTAIR 组比较,dP<0.05；与si-HOTAIR+inhibitor NC 组比较,eP<0.05

2.4过表达或沉默HOTAIR 对IUA HESC 细胞凋亡的影响 pcDNA-HOTAIR 组IUA HESC 细胞凋亡率低于Ct 组、pcDNA 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR 组IUA HESC 细胞凋亡率高于Ct 组、si-NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 组IUA HESC 细胞凋亡率低于si-HOTAIR组、si-HOTAIR+inhibitor NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4,表5。

表5 七组IUA HESC 细胞凋亡率比较(,%,n=6)

注：与Ct 组比较,aP<0.05；与pcDNA 组比较,bP<0.05；与si-NC 组比较,cP<0.05；与si-HOTAIR 组比较,dP<0.05；与si-HOTAIR+inhibitor NC 组比较,eP<0.05

图4 流式细胞术检测IUA HESC 细胞凋亡

2.5过表达或沉默HOTAIR 对IUA HESC 细胞纤维化的影响 pcDNA-HOTAIR 组IUA HESC 细胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表达水平高于Ct 组、pcDNA 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR 组IUA HESC 细胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表达水平低于Ct 组、si-NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 组IUA HESC 细胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表 达水平高于si-HOTAIR 组、si-HOTAIR+inhibitor NC 组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图5,表6。

图5 western blot 检测IUA HESC 细胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表达

表6 七组IUA HESC 细胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表达比较(,n=6)

表6 七组IUA HESC 细胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表达比较(,n=6)

注：与Ct 组比较,aP<0.05；与pcDNA 组比较,bP<0.05；与si-NC 组比较,cP<0.05；与si-HOTAIR 组比较,dP<0.05；与si-HOTAIR+inhibitor NC 组比较,eP<0.05

2.6HOTAIR 靶向调控miR-326/NUS1 轴 starbase 预测lncRNA HOTAIR 与miR-326、miR-326 与NUS1 的结合位点,见图6。miR-326 mimic 和HOTAIR-WT 共转染组的荧光素酶活性低于mimic NC 和HOTAIR-WT共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)；mimic NC 和HOTAIR-MUT 共转染组与miR-326 mimic 和HOTAIRMUT 共转染组的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-326 mimic 和NUS1-WT 共转染组的荧光素酶活性低于mimic NC 和NUS1-WT 共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)；mimic NC 和NUS1-MUT共转染组与miR-326 mimic 和NUS1-MUT 共转染组的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。bio-lncRNA HOTAIR 沉淀中 的lncRNA HOTAIR 和miR-326 水平均显著高于bio-NC,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图7。

表7 荧光素酶活性比较(,n=6)

表7 荧光素酶活性比较(,n=6)

注：与mimic NC 和HOTAIR-WT 共转染组比较,aP<0.05；与mimic NC 和NUS1-WT 共转染组比较,bP<0.05

图6 starbase 预测lncRNA HOTAIR 与miR-326、miR-326 与NUS1 的结合位点

图7 RNA pull down 验证HOTAIR 与miR-326 的靶向结合

3 讨论

IUA 是以子宫内膜损伤后宫腔前后壁部分或全部粘连为特征的常见妇科疾病。临床表现包括月经量减少、闭经、不孕、前置胎盘、反复流产、早产、胎盘粘连、胚胎着床困难、胎盘发育异常等,严重影响女性的生殖健康［10］。IUA 的治疗主要是宫腔镜手术分离粘连,其次是防止再粘连,治疗目的是恢复宫腔形态、促进内膜生长、改善妊娠结局。然而,统计发现轻、中度IUA 治疗后的再粘连率为30%,而严重者高达62.5%。且妊娠率仅为22.5%～33.3%［11］。据报道,子宫内膜纤维化进展参与了IUA 的发生、发展［12］。因此,探究IUA 子宫内膜纤维化相关的分子机制具有重要意义。

lncRNA 可参与纤维化疾病的各种生物学功能［13,14］。HOTAIR 作为一 种位于HOXC 基因座 的lncRNA,已有研究报道称沉默HOTAIR 可抑制单侧输尿管阻塞大鼠肾间质纤维化［15］；降低HOTAIR 表达可抑制高糖诱导的糖尿病肾病系膜细胞纤维化［16］。表明HOTAIR 参与了纤维化疾病的进展。本研究通过TGF-β1诱导HESC 以构建IUA 体外细胞纤维化模型,并检测了HOTAIR 在IUA 子宫内膜组织及IUA HESC细胞中的表达,结果显示HOTAIR 在IUA 子宫内膜组织及IUA HESC 细胞中上调。COL1A1、FN、α-SMA作为衡量纤维化的常见指标,已有研究显示,槲皮素通过降低TGF-β1诱导的子宫内膜基质细胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表达来抑制细胞纤维化反应［17］。本研究显示,过表达HOTAIR 可促进IUA HESC 细胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表达,而沉默HOTAIR 则可抑制IUA HESC 细胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表达,提示沉默HOTAIR 可抑制IUA HESC 细胞纤维化。此外,本研究还发现,过表达HOTAIR 可促进IUA HESC 细胞增殖,抑制细胞凋亡,而沉默HOTAIR 则呈相反趋势。表明沉默HOTAIR 可能通过抑制细胞增殖,促进细胞凋亡的方式来抑制细胞纤维化。

lncRNA 可通过海绵吸附miRNA 来发挥其生物学功能。本研究通过生物信息学分析发现HOTAIR 与miR-326 存在结合位点。miR-326 是一种与纤维化疾病有关的miRNA,据报道,miR-326 在IUA 子宫内膜组织中的表达低于正常子宫内膜组织,并且与纤维化标志物(α-SMA、COL1A1 和 FN)的表达呈负相关［18］。以上研究表明miR-326 可抑制IUA 进展。本研究结果与其是一致的,本研究显示,miR-326 在IUA 子宫内膜组织及IUA HESC 细胞中低表达,过表达HOTAIR 可抑制IUA HESC 细胞中miR-326 表达,沉默HOTAIR可促进IUA HESC 细胞中miR-326 表达,且双荧光素酶报告基因和RNA pull down 实验证实了HOTAIR 可与miR-326 靶向结合,推测沉默HOTAIR 可能通过上调miR-326 表达抑制IUA HESC 细胞纤维化。为了验证该推测,本研究在沉默HOTAIR 的基础上再加上miR-326 inhibitor 干预IUA HESC 细胞,结果显示,miR-326 inhibitor 减弱了沉默HOTAIR 对IUA HESC 细胞纤维化的抑制作用,证实了沉默HOTAIR 可能通过上调miR-326 表达抑制IUA HESC 细胞纤维化。

miRNAs 可直接结合靶向mRNA 的3'端非翻译区(3'UTR)以降解靶向mRNA 或抑制翻译［19］。为了进一步探究沉默HOTAIR 可能通过上调miR-326 表达抑制IUA HESC 细胞纤维化的分子机制,本研究通过starbase 预测发现miR-326 与NUS1 存在结合位点。NUS1,也称为 NgBR,是一种跨膜受体蛋白,已有研究显示,NUS1 在人IUA 组织中异常高表达,过表达NUS1 减弱了IUA 后的子宫内膜上皮细胞凋亡作用［20］,提示NUS1 参与了IUA 进展。本研究发现,NUS1 蛋白在IUA 子宫内膜组织及IUA HESC 细胞中高表达,过表达HOTAIR 后,IUA HESC 细胞中miR-326 下调表达,NUS1 蛋白上调表达；沉默HOTAIR 后,IUA HESC 细胞中miR-326 上调表达,NUS1 蛋白下调表达,且双荧光素酶报告基因实验证实了NUS1 蛋白可与miR-326靶向结合,以上结果表明沉默HOTAIR 可能通过海绵化miR-326 来下调NUS1 表达进而抑制IUA HESC 细胞纤维化。

综上所述,沉默HOTAIR 可能通过海绵化miR-326 来下调NUS1 表达进而抑制IUA HESC 细胞纤维化,该研究可能为IUA 的治疗提供潜在的靶点。