王廷刚, 薛 峰, 李 宇, 牛兆健, 王 野

(1.青岛海慈医疗集团普外科，山东 青岛 266000;2.青岛大学医学院附属医院普外科，山东 青岛 266000)

结肠癌是常见的发生于消化系统的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤第2位和第4位。目前对结肠癌的形成、发展、治疗和预后虽有新的认识，但仍未发现合适的标记物用于分析结肠癌的发病机制、诊断和治疗[1-2]。

结肠癌的发生是一个多步骤、多因素和多阶段的过程，目前对结肠癌的研究[3]主要集中在mRNA和蛋白水平。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的小分子非编码RNA，可在转录后调控基因的表达，目前关于miRNA抑制肿瘤发生的研究[4]逐渐增多，miR-26a是miRNA的一种，其在肿瘤中作用的研究[5]也明显增多。研究[6]显示：在鼻咽癌组织和细胞中miR-26a表达水平降低，并通过靶向EZH2基因抑制癌细胞的生长和致瘤性。高迁移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGA1)是miR-26a的一个靶基因，miR-26a可靶向HMGA1调控膀胱癌细胞的生长、凋亡、侵袭和迁移[7]。作为HMGA家族一员，HMGA1在人类各种肿瘤发生发展中起重要作用[8]。miR-26a在不同癌症中的功能与其靶标有关，关于其靶向调节HMGA1对结肠癌细胞的生物学特性的影响机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨miR-26a靶向HMGA1对结肠癌细胞生长、侵袭和迁移的影响，以期为后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人结肠癌SW480细胞购自中国科学院细胞库。胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰酶和青链霉素购自美国Gibco公司，BCA和CCK8试剂盒购自中国碧云天生物技术有限公司，SYBR Green购自上海生工生物工程有限公司，双荧光报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司，miR-26a mimics、miR-26a inhibitor和miR-NC购自广州锐博生物科技有限公司，pcDNA3.1载体购自美国Invitrogen公司，PGL3荧光素酶报告基因载体购自北京普洛麦格生物技术有限公司。CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司，倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，实时定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 细胞培养 将装有人结肠癌SW480细胞的冻存管从液氮罐中取出，37℃水浴解冻后，采用移液枪将细胞转移到5 mL无菌离心管中，加入含有10%FBS、100 mg·L-1链霉素和100 U·L-1青霉素的RPMI 1640培养基中，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清，加入细胞培养液悬浮细胞，接种到细胞培养板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞贴壁后换液1次，之后每2～3 d换液1次，细胞融合度达到80%～90%时进行传代。

1.3 细胞转染和细胞中HMGA1 mRNA和蛋白表达水平检测 取生长至对数期的人结肠癌SW480细胞，加入0.25 %胰酶消化细胞，消化完全后将细胞转移到新的离心管中，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清，加入不含有胎牛血清的不完全培养液接种到细胞培养板中，在37℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞融合度达60%时，将miR-NC(miR-NC组)、miR-26a mimics(模拟物，miR-26a mimics组)和miR-26a inhibitor(抑制物，miR-26a inhibitor组)与不完全培养基混合后加入至人结肠癌SW480细胞中，滴加至24孔板表面，37℃、5% CO2培养箱中培养48 h。采用定量RT-PCR(qRT-PCR)和Western blotting法检测SW480细胞中HMGA1 mRNA和蛋白表达水平。

1.4 荧光素酶报告基因检测各组SW480细胞中双荧光素酶活性 通过TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTa(http://pictar.mdc-berlin.de/)和The miRBase(http://mirbase.org/)三大靶基因预测库预测到miR-26a与HMGA1的3′-UTR有结合位点。将含有miR-26a结合位点HMGA1的3′-UTR片段插入PGL3荧光素酶报告基因载体，构建野生型和突变型HMGA1的3′-UTR荧光素酶报告载体，分别命名为Wt-HMGA1和Mut-HMGA1。将构建好的质粒进行共转染并分为3组，即miR-NC+miR-26a mimics组、Wt-HMGA1+miR-26a mimics组和Mut-HMGA1+miR-26a mimics组。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组SW480细胞中双荧光素酶活性。

1.5 CCK8法检测人结肠癌SW480细胞增殖活力 取转染后生长至对数期的 miR-NC组、miR-26a mimics组和miR-26a inhibitor组细胞，采用细胞培养液悬浮细胞，细胞浓度调整为3×105mL-1，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24、48和72 h后，加入10 μL CCK8溶液，置于37℃、5% CO2培养箱孵育2 h，酶标仪在490 nm波长处测定并记录各组吸光度(A)值，以A值反映细胞的增殖活力。

1.6 CCK8法检测转染后细胞增殖活力 将人结肠癌SW480细胞分为miR-NC组(未转染)、miR-26a mimics组(未转染)、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1质粒共转染组(miR-26a mimics转染pcDNA3.1-HMGA1质粒)和miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1质粒共转染组(miR-NC转染pcDNA3.1-HMGA1质粒)。取各组对数生长期的人结肠癌SW480细胞，采用0.25 %胰酶消化细胞，转移细胞至新的EP管中，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，与不完全培养液接种到细胞培养板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24、48和72 h后，参照1.3步骤检测各组细胞的A值，以A(490)/A(630)反映各组细胞的增殖活力。

1.7 Transwell小室法检测各组SW480细胞中侵袭细胞数 将细胞分为miR-NC组、miR-26a mimics组、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1质粒共转染组和 miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1质粒共转染组。取生长至对数期的人结肠癌SW480细胞，调整细胞浓度为1×105mL-1，取100 μL细胞悬液接种于覆盖有Matrigel基质胶的Transwell小室的上室，下层加入含10% FBS的RPMI 1640培养基500 μL，培养72 h后弃去培养液，用棉签轻轻拭掉膜上的细胞，HE染色后在倒置显微镜下观察各组侵袭细胞数。

1.8 Transwell小室法检测各组SW480细胞中迁移细胞数 将细胞分为miR-NC组、miR-26a mimics组、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1质粒共转染组和miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1质粒共转染组。除了Transwell室上未铺Matrigel基质胶外，其他的操作如同1.7步骤。

2 结 果

2.1 各组SW480细胞中 HMGA1 mRNA和蛋白表达水平及荧光素酶活性 miR-26a mimics组SW480细胞中HMGA1 mRNA表达水平(0.273±0.092)低于miR-NC组(0.992±0.112)(t=8.592，P=0.001)，miR-26a inhibitor组SW480细胞 中HMGA1 mRNA表达水平(3.754±0.241)高于miR-NC组(t=18.001，P=0.000)，Western blotting检测各组SW480细胞中HMGA1蛋白表达水平见图1～3。Wt- HMGA1+miR-26a mimics共转染组荧光素酶活性(0.383±0.054)低于miR-NC+miR-26a mimics共转染组(1.030±0.071)(t=12.563，P=0.000)，而Mut-HMGA1+miR-26a mimics共转染组与miR-NC+miR-26a mimics共转染组(1.001±0.081)SW480细胞中荧光素酶活性比较差异无统计学意义(t=0.466，P=0.665)，见图4，即HMGA1是miR-26a的靶基因。

2.2 各组人结肠癌SW480细胞增殖活力 miR-NC、miR-26a mimics和miR-26a inhibitor组细胞转染24(F=15.516，P=0.004)、48(F=41.849，P=0.000)和72 h(F=85.050，P=0.000)后细胞增殖活力比较差异均有统计学意义，miR-26a mimics组细胞增殖活力在上述3个时间点均明显低于miR-NC组(t24=2.566，P24=0.043；t48=4.721，P48=0.003；t72=6.547，P72=0.001)，而miR-26a inhibitor组细胞增殖活力在上述3个时间点均明显高于miR-NC组(t24=2.999，P24=0.024；t48=4.426，P48=0.004；t72=6.496，P72=0.001)。见图5和表1。

A:miR-NC group;B:miR-26a mimics group;C:miR-26a inhibitor group.*P<0.05vsmiR-NC group.

图1 各组SW480细胞中 HMGA1 mRNA表达水平

Fig.1 Expression levels of HMGA1 mRNA in SW480 cells in various groups

Lane 1:miR-NC+miR-26a inhibitor group;Lane 2:Wt-HMGA1+miR-26a mimics group;Lane 3:Mut-HMGA1+miR-26a mimics group.

图2 各组SW480细胞中HMGA1蛋白表达电泳图

Fig.2 Electrophoregram of HMGA1 protein in SW480 cells in various groups

A:miR-NC group;B:miR-26a mimics group;C:miR-26a inhibitor group.*P<0.01vsmiR-NC group.

图3 各组SW480细胞中HMGA1蛋白表达水平

Fig.3 Expression levels of HMGA1 protein in SW480 cells in various groups

2.3 共转染后各组细胞增殖活力 miR-NC组、miR-26a mimics组、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组和 miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组细胞转染24(F=56.233，P=0.000)、48(F=60.131，P=0.000)和72 h(F=78.398，P=0.000)后SW480细胞增殖活力比较差异均有统计学意义；miR-26a mimics组(t24=7.537，P24=0.000；t48=8.265，P48=0.000；t72=10.416，P72=0.000)、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组(t24=2.895，P24=0.028；t48=4.216，P48=0.003；t72=5.149，P72=0.001)细胞增殖活力在3个时间点均明显低于miR-NC组，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力在3个时间点均明显高于miR-NC组(t24=4.264，P24=0.003；t48=4.484，P48=0.002；t72=4.002，P72=0.004)；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力在3个时间点明显高于miR-26a mimics组(t24=4.427，P24=0.002；t48=4.049，P48=0.004；t72=5.267，P72=0.001)，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组(t24=7.026，P24=0.000；t48=8.700，P48=0.002；t72=9.151，P72=0.004)。见表2。

A:miR-NC+miR-125a mimics;B:Wt-HMGA1+miR-125a mimics;C:Mutt-HMGA1+miR-125a mimics.*P<0.01vsmiR-NC+miR-26a mimics group.

图4 各组SW480细胞中双荧光素酶活性

Fig.4 Duble luciferase activities of SW480 cells in various groups

2.4 共转染后各组SW480细胞侵袭细胞数 miR-NC组、miR-26a mimics组、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组和miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组细胞转染72 h后，Transwell小室法检测细胞侵袭结果显示：miR-26a mimics组和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组侵袭细胞数均明显低于miR-NC组(t1=12.953，P1=0.000；t2=4.741，P2=0.002)，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组侵袭细胞数明显高于miR-NC组(t=4.956，P=0.001)；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组侵袭细胞数明显高于miR-26a mimics组(t=8.212，P=0.000)，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组(t=9.697，P=0.000)。见表3。

*P<0.05 vs miR-NC group.

Fig.5 Proliferation activities of cells in various groups detected by CCK8 method

表1 不同时间点各组结肠癌SW480细胞的增殖活力

Group Prolieration activity(t/h) 2448 72 miR-NC0.345±0.036 0.462±0.041 0.578±0.046 miR-26a mimics0.262±0.036*0.286±0.042*0.322±0.043*miR-26a inhibi-tor0.442±0.046*0.627±0.053*0.832±0.054*F15.51641.84985.050P0.0040.0000.000

*P< 0.05vsmiR-NC group.

2.5 共转染后各组SW480细胞中迁移细胞数 miR-NC组、miR-26a mimics组、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组和 miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组细胞转染72 h后，Transwell小室法检测结果显示：miR-26a mimics组和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组迁移细胞数均明显低于miR-NC组(t1=10.456，P1=0.000；t2=4.809，P2=0.001)，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组迁移细胞数明显高于miR-NC组(t=5.590，P=0.001)；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组迁移细胞数明显高于miR-26a mimics组(t=16.046，P=0.000)，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组(t=10.400，P=0.000)。见表3。

表2 不同时间点共转染后各组细胞增殖活力

Group Proliferation activity (t/h) 244872miR-NC 0.366±0.0360.538±0.0410.697±0.046miR-26a mimics0.206±0.036*△0.291±0.041*△0.343±0.043*△miR-26a mimics +pcDNA3.1-HMGA10.469±0.031*0.412±0.034*0.522±0.039*miR-NC + pcDNA3.1-HMGA10.625±0.034*△0.672±0.029*△0.833±0.038*△F79.07360.13178.398P0.0000.0000.000

*P<0.01vsmiR-NC group;△P<0.01vsmiR-26a mimics + pcDNA3.1-HMGA1 group.

3 讨 论

在过去的几十年间，研究者[9-10]发现：miRNA可作为主要的调控因子参与肿瘤的发生，这给肿瘤分子途径的研究提供了新的视角，针对不同类型、不同时期和级别的肿瘤参与调控的miRNA可能不同，这使miRNA作为特异性肿瘤标志物成为可能。miR-26a在肿瘤方面已有很多研究，但其在肿瘤发生中的角色仍有争议[11]。研究[12-15]显示：miR-26a在肝癌和乳腺癌等肿瘤中表达水平下调，其与靶基因结合可抑制肿瘤生长；但在肺癌和胆囊癌中可通过糖原合成激酶3β(GSK-3β)使miR-26a表达水平上调，促进肿瘤的发生。miR-26a表达和生物学功能的不同可能与癌细胞遗传背景有关。miR-26a在结肠癌细胞中的作用尚未清楚，因此本研究的目的是探讨miR-26a的生物学特性。

表3 共转染后各组侵袭细胞数

Tab.3 Number of invasion cells in various groups after co-transfection

GroupNumber of invasion cellsNumber ofmigration cellsmiR-NC139.8±5.6189.8±8.7miR-26a mimics67.4±6.2*97.4±9.6*miR-26a mimics+ pcDNA3.1-HM-GA1113.3±7.1*△#147.3±10.5*△#miR-NC+ pcDNA3.1-HM-GA1167.5±8.2*239.2±13.8*F116.16893.540P 0.0000.000

*P<0.01vsmiR-NC group;△P<0.01vsmiR-26a mimics group;#P<0.01vsmiR-NC+pcDNA3.1-HMGA1 group.

不同肿瘤中miR-26a的作用可能不同，这与所调控的靶基因有关[16]。HMGA1可调节多个转录因子的功能，其作为癌基因在肿瘤的发生发展中起重要作用，其在正常人中一般低表达或者表达缺失，而在一些癌症患者中常过度表达[17]。研究[18]显示：HMGA1的过度表达与膀胱癌的肿瘤分期、等级、复发和预后有关，降低HMGA1的表达可阻滞细胞周期和降低细胞活性。为了验证miR-26a是否与HMGA1共同参与结肠癌的发生发展，本研究首先验证了HMGA1是否为miR-26a的靶基因，将构建的野生型和突变型HMGA1的3′-UTR荧光素酶报告载体转染至人结肠癌SW480细胞中，并通过共转染检测细胞中荧光素酶活性，结果证实HMGA1是miR-26a的靶基因。

研究[19]显示：miR-26a在肝癌中表达下调，其表达与肝癌患者的生存期及对干扰素的敏感性有关。在乳腺癌细胞和组织中miR-26a表达水平下调，将miR-26a mimics转染细胞可明显抑制细胞的生长[20]。本研究将miR-NC、miR-26a mimics和miR-26a inhibitor共转染人结肠癌SW480细胞，转染24、48和72 h后CCK8实验检测结果显示：miR-26a mimics组细胞活力明显低于miR-NC组，miR-26a inhibitor组细胞活力明显高于miR-NC组，说明miR-26a在人结肠癌发生中起重要作用。

研究[21-22]显示：HMGA基因相关的miRNA在垂体腺瘤中表达下调，进而使HMGA1和HMGA2表达上调，但在无功能的垂体腺瘤中，下调miRNA与HMGA1上调无关，说明能够靶向HMGA基因的miRNA下调可增加人垂体腺瘤中HMGA蛋白表达。研究[23-24]显示：miR-296可通过抑制HMGA1转录从而抑制HMGA1表达，当强制表达miR-296后，可通过上调HMGA1明显降低人前列腺癌细胞的增殖和侵袭，表明HMGA1可作为miRNA的靶基因对癌细胞发生发展起作用。已有研究[25-27]证实HMGA1是miR-26a的靶基因，但miR-26a是否靶向调控HMGA1对结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移起作用尚不清楚。本研究结果显示：miR-26a mimics组和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组细胞活力、侵袭和迁移数均明显低于miR-NC组，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组细胞活力、侵袭和迁移数均明显高于miR-NC组；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组细胞活力、侵袭和迁移数明显高于miR-26a mimics组，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组，说明miR-26a靶向HMGA1调控结肠癌细胞的生物学特性。

综上所述，HMGA1是miR-26a的靶基因，上调miR-26a表达可抑制人结肠癌SW480细胞增殖，下调miR-26a表达可促进细胞增殖，miR-26a可靶向HMGA1抑制细胞增殖、侵袭和迁移。