李立恒 王蕊 王芹 张智轶 安峰 张璇 王晓明 张凡

河北北方学院附属第一医院1口腔科，2病理科（河北张家口 075000）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，且癌细胞的增殖、侵袭和转移是OSCC 患者死亡的主要原因［1-2］。因此，阐明OSCC 的潜在分子机制有助于为OSCC 患者确定新的治疗策略。近年来研究发现［3-4］，MicroRNA（miRNA）在包括OSCC 在内的人类癌症中异常表达，且在肿瘤的发生、进展和转移中起着至关重要的作用。有研究显示［5］，位于染色体19q13.41 上的miR-498 在三阴性乳腺癌细胞中高表达，下调miR-498 可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖；而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，PCK1）作为糖异生途径中的一个限速酶，在肝癌细胞中低表达，过表达PCK1 可抑制肝癌细胞的增殖［6］。但miR-498 及PCK1 对OSCC 细胞生长的影响尚未见报道，基于此，本研究主要探讨miR-498 对OSCC 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用以及内部的分子机制，以期为OSCC 的临床诊治提供新的分子靶标。

1 材料与方法

1.1 OSCC 组织和细胞系 收集2019年2月至2021年2月期间，在本院采用外科切除术进行手术治疗的OSCC 患者的OSCC 组织及与之匹配的癌旁组织，共150 对。将所有组织标本置于液氮中冷冻保存备用，所有患者均签署知情同意书。人OSCC 细胞系HSC-3、SCC-15、SCC-9 及人正常口腔角质细胞HOK 均购自美国典型菌种保藏中心。

1.2 主要试剂与仪器 miR-498 模拟物（miR-498 mimics）及其阴性对照（miR-NC）、miR-498 抑制物（anti-miR-498）及其阴性对照（anti-miR-NC）、siRNA PCK1（si-PCK1）及其阴性对照（si-NC）、PCK1过表达物（OE-PCK1）及其阴性对照（OE-NC）均购自美国ThermoFisher 公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒、胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基、BCA试剂盒均购自美国Bio-Rad 公司；PrimeScriptTMRT Master Mix、TransStart®Green qPCR SuperMix 均 购自TaKaRa公司；Trizol试剂、ECL化学发光试剂盒均购自美国Sigma 公司；PCK1、GAPDH 兔多克隆抗体（anti-PCK1、anti-GAPDH）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗均购自美国Abcam 公司；荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司；CO2培养箱均购自德国SIGMA 公司。

1.3 细胞培养与转染 人OSCC 细胞系HSC-3、SCC-15、SCC-9 及人正常口腔角质细胞HOK 均在含有10% FBS 的DMEM 培养基中培养，培养条件为37 ℃、5% CO2。收集对数生长期的SCC-15 细胞，严格按照LipofectamineTM2000 转染试剂盒操作说明书操作步骤对SCC-15 细胞进行转染，并分组为：对照组（细胞未转染）、miR-NC 组（miR-NC 转染细胞）、miR-498 mimics 组（miR-498 mimics 转染细胞）、anti-miR-NC 组（anti-miR-NC 转染细胞）、antimiR-498 组（anti-miR-498 转染细胞）、miR-NC+OENC 组（miR-NC 和OE-NC 共转染细胞）、miR-NC+OE-PCK1 组（miR-NC 和OE-PCK1 共转染细胞）、miR-498 mimics+OE-NC 组（miR-498mimics 和OENC 共转染细胞）、miR-498 mimics+OE-PCK1 组（miR-498 mimics 和OE-PCK1 共转染细胞）、antimiR-NC+si-NC 组（anti-miR-NC 和si-NC 组共转染细胞）、anti-miR-NC+si-PCK1 组（anti-miR-NC 和si-PCK1 共转染细胞）、anti-miR-498+si-NC 组（antimiR-498 和si-NC 共转染细胞）、anti-miR-498+si-PCK1 组（anti-miR-498 和si-PCK1 共转染细胞）。

1.4 qRT-PCR 检测OSCC 组织及细胞中miR-498表达水平 Trizol 试剂用于从OSCC 组织及细胞中提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix 合成cDNA，利用TransStart®Green qPCR SuperMix 在ABI 7500 荧光定量PCR 系统上进行PCR 扩增反应，并使用以下引物：miR-498 正向：5′-GGTTTGAAGCCAGGCGGTTTC-3′，反向：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6 正向：5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′，反向：5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCt方法以U6 作为内部对照计算miR-498 相对表达水平。

1.5 CCK-8 法检测细胞增殖 将各组SCC-15 细胞以2×104个/孔的密度接种在96 孔板中，并在补充有10% FBS 的DMEM 中孵育过夜。在转染后24、48、72 h，分别向每孔中加10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃下孵育2 h 后，利用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 将各组SCC-15细胞经胰蛋白酶消化后，用PBS 洗涤，并用20 μL 膜联蛋白V 结合缓冲液将细胞重悬，然后将10 μL 膜联蛋白V 异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）加入细胞重悬液中，37 ℃下孵育15 min，并在黑暗中加入5 μL 碘化丙啶（PI）复染30 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Transwell 实验检测细胞侵袭与迁移 对于细胞迁移实验，将细胞以3×104个/mL 的密度接种到Transwell 上腔室中，并将500 μL 含有10% FBS的DMEM 培养液作为化学引诱剂添加到Transwell下腔室。在5%CO2、37 ℃条件下孵育24 h 后，用棉签刮去上腔室中的细胞，并用100%甲醇固定，0.4%结晶紫染色20 min。然后，漂洗细胞并干燥。在倒置显微镜下随机选择6 个视图观察，并统计细胞迁移数目。

对于细胞侵袭实验，将基质胶预先涂在Transwell 上腔室中，待其自然干燥后，将细胞以5×104个/mL 的密度接种到预先涂有基质胶的上腔室中，其余步骤同细胞迁移实验。

1.8 双荧光素酶报告基因实验验证miR-498 与PCK1靶向关系 使用targetscan 网站预测miR-498与PCK1 的结合位点。分别构建PCK1 的野生型（WT）和突变型（MUT）3′-UTR 区质粒，标记为WTPCK1、MUT-PCK1。按照LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书将WT-PCK1 和MUT-PCK1 分别与miR-NC 或miR-498 mimics 共转染于SCC-15 细胞，每组设置6 个复孔，转染48 h 后，使用双重荧光素酶报告基因分析系统评估相对荧光素酶活性。

1.9 Western blot检测PCK1蛋白表达 使用总蛋白提取试剂盒从细胞中提取总蛋白，并通过BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶进行电泳以分离等量的蛋白质，然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，将膜用5%脱脂牛奶在37 ℃下封闭2 h，然后与一抗anti-PCK1、anti-GAPDH在4 ℃下孵育过夜。第二天用TBST 将膜洗涤后，加入HRP 标记的羊抗兔二抗于室温下孵育1 h，利用ECL 发光试剂盒可视化蛋白，Image 软件对灰度值进行量化分析。

1.10 统计学方法 所有统计分析采用SPSS 25.0版进行，数据用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-498 在OSCC 组织及细胞中的表达OSCC 组织中miR-498 的表达水平明显高于癌旁组织［（2.65 ± 0.34）vs.（1.04 ± 0.15），P＜0.05］；与人正常口腔角质细胞HOK（1.03±0.14）比较，人OSCC细胞系HSC-3（2.05 ± 0.21）、SCC-15（2.75 ± 0.31）、SCC-9（2.31 ± 0.28）中miR-498 的表达水平显著升高（F= 53.639，P＜0.001），且SCC-15 细胞中miR-498 的表达水平最高，因此选择SCC-15 细胞作为后续的研究对象。

2.2 miR-498对SCC-15细胞增殖与凋亡的影响与对照组和miR-NC 组比较，miR-498 mimics 组SCC-15、OD450值（24、48、72 h）显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；与对照组和anti-miR-NC 组比较，anti-miR-498 组SCC-15 细胞OD450值（24、48、72 h）显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图1。

图1 miR-498 对SCC-15 细胞细胞凋亡率及OD450值的影响Fig.1 Effects of miR-498 on apoptosis rate and OD450 value of SCC-15 cells

2.3 miR-498 对SCC-15 细胞迁移与侵袭的影响 miR-498 mimics 组SCC-15 细胞迁移与侵袭数目显著高于对照组和miR-NC 组（P＜0.05）；antimiR-498 组SCC-15 细胞迁移与侵袭数目显著低于对照组和anti-miR-NC 组（P＜0.05），见表1、图2。

表1 miR-498 对SCC-15 细胞迁移数目及侵袭数目的影响Tab.1 Effect of mir-498 on migration number and invasion number of scc-15 cells ±s

表1 miR-498 对SCC-15 细胞迁移数目及侵袭数目的影响Tab.1 Effect of mir-498 on migration number and invasion number of scc-15 cells ±s

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与miR-NC 组比较，bP ＜0.05；与anti-miR-NC 组比较，cP ＜0.05

分组对照组miR-NC 组miR-498 mimics 组anti-miR-NC 组anti-miR-498 组F 值P 值迁移细胞数目（个）132.46±15.37 130.56±14.67 160.68±18.63ab 135.12±16.29 65.42±6.33ac 34.048＜0.001侵袭细胞数目（个）85.52±7.39 87.82±8.16 125.54±12.81ab 86.32±8.46 30.49±4.35ac 91.956＜0.001

图2 Transwell 实验检测细胞迁移及侵袭Fig.2 Transwell assay for cell migration and invasion

2.4 miR-498 靶向调控PCK1 的表达 使用targetscan 预测miR-498 与PCK1 存在结合位点，见图3。双荧光素酶报告基因实验结果表明，与miR-NC+WT-PCK1 组（1.07 ± 0.13）比较，miR-498 mimics+WT-PCK1 组（0.36±0.08）荧光素酶相对活性显著降低（P＜0.05），而miR-498 mimics+MUT-PCK1 组（1.08 ± 0.11）荧光素酶相对活性与miR-NC+MUTPCK1组（1.10±0.14）差异无统计学意义（P＞0.05）。Western blot 结果显示，miR-498 mimics 组（0.23 ±0.02）SCC-15 细胞中PCK1 蛋白表达水平显著低于对照组（0.51±0.08）和miR-NC 组（0.49±0.06）（P＜0.05）；anti-miR-498 组（1.03 ± 0.05）SCC-15 细胞中PCK1 蛋白表达水平显著高于对照组（0.51 ± 0.08）和anti-miR-NC 组（0.48±0.07）（P＜0.05），见图4。

图3 使用targetscan 网站预测miR-498 与PCK1 的结合位点Fig.3 Predicted the binding site of mir-498 to PCK1 using targetscan website

图4 Western blot 检测各组细胞中PCK1 蛋白表达Fig.4 The expression of PCK1 protein in cells of each group was detected by western blot

2.5 共转染miR-498 和PCK1 对SCC-15 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响 PCK1 上调可显著减弱miR-498 mimics 对SCC-15 细胞增殖、迁移和侵袭能力的增强作用，并显著减弱miR-498 mimics对SCC-15 细胞凋亡的抑制作用，见表2、图5-6；PCK1 下调可显著减弱anti-miR-498 对SCC-15 细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用，并显著减弱anti-miR-498 对SCC-15 细胞凋亡的促进作用，见表3、图7-8。

表2 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共转染对SCC-15 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响Tab.2 Effects of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 onproliferation，apoptosis，migration and invasion of SCC-15 cells ±s

表2 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共转染对SCC-15 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响Tab.2 Effects of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 onproliferation，apoptosis，migration and invasion of SCC-15 cells ±s

注：与miR-NC+OE-NC 组比较，aP ＜0.05；与miR-NC+OE-PCK1 组比较，bP ＜0.05；与miR-498mimics+OE-NC 组比较，cP ＜0.05

分组miR-NC+OE-NC 组miR-NC+OE-PCK1 组miR-498mimics+OE-NC 组miR-498mimics+OE-PCK1 组F 值P 值OD450值24 h 0.41±0.06 0.18±0.04a 0.61±0.07a 0.39±0.05bc 58.841＜0.001 48 h 0.99±0.14 0.35±0.06a 1.23±0.16a 0.91±0.12bc 52.658＜0.001 72 h 1.33±0.24 0.54±0.09a 1.76±0.30a 1.30±0.22bc 30.255＜0.001细胞凋亡率（%）13.96±1.72 46.35±5.23a 7.25±1.36a 16.87±2.65bc 183.395＜0.001迁移细胞数目（个）125.51±15.33 62.56±6.56a 168.15±18.78a 120.36±16.74bc 49.577＜0.001侵袭细胞数目（个）84.36±8.36 32.25±4.67a 123.66±12.36a 77.56±8.21bc 107.994＜0.001

表3 anti-miR-498 和si-PCK1 共转染对SCC-15 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响Tab.3 Effects of anti-miR-498 and si-PCK1 co transfection on proliferation，apoptosis，migration and invasion of SCC-15 cells x±s

图5 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共转染对SCC-15 细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 on the apoptosis of SCC-15 cells

图6 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共转染对SCC-15 细胞迁移及侵袭的影响Fig.6 Effect of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 on migration and invasion of SCC-15 cells

图7 anti-miR-498 和si-PCK1 共转染对SCC-15 细胞凋亡的影响Fig.7 Effects of anti-miR-498 and si-PCK1 co transfection on apoptosis of SCC-15 cells

图8 anti-miR-498 和si-PCK1 共转染对SCC-15 细胞迁移及侵袭的影响Fig.8 Effects of anti-miR-498 and si-PCK1 co transfection on migration and invasion of SCC-15 cells

3 讨论

OSCC 的特点是局部侵袭性强、颈部淋巴结转移，其发生发展是一个复杂的过程，受多种因素影响，多种基因参与并协同作用，不同基因发挥不同作用［7］。尽管近年来在OSCC 的诊断和治疗方面已经取得了较大的进步，但OSCC 患者的5年生存率仍然低于50%［8］。因此，确定OSCC 的发病机制对于开发新的治疗策略具有重要的意义。

miRNAs 是一类没有蛋白质编码能力的内源性单链RNAs，且miRNA 可以通过互补作用与其靶mRNA 的3′非翻译区结合，从而在转录后水平的基因表达中发挥调节作用［9-10］。miR-498 是一种在肿瘤细胞的生长、侵袭与转移过程中发挥重要调节作用的miRNA［11］。据报道，miR-498 可促进肾上腺皮质癌细胞的增殖，下调miR-498 表达后，肾上腺皮质细胞增殖明显下降［12］；下调miR-498 在OSCC 细胞SCC-15 中的表达可显著降低细胞侵袭和迁移［13］；miR-498 在乳腺癌细胞中高表达，其通过抑制PTEN 促进乳腺癌细胞的增殖和迁移［14］；miR-498 在转移性甲状腺髓样癌中的表达水平显著高于原发性甲状腺髓样癌［15］。以上研究表明miR-498 在多种肿瘤中发挥着癌基因的作用。本研究结果与其是一致的，本研究结果显示，miR-498 在OSCC 组织和细胞HSC-3、SCC-15、SCC-9 中高表达，且SCC-15 细胞中miR-498 的表达水平最高，因此，选择SCC-15 细胞进行转染实验；本研究还发现，过表达miR-498 可促进SCC-15 细胞的增殖、迁移及侵袭，抑制细胞凋亡，而下调miR-498 可抑制SCC-15 细胞的增殖、迁移及侵袭，促进细胞凋亡，提示miR-498 在SCC-15 细胞中具有促癌的作用。

为了进一步探究miR-498 在SCC-15 细胞中促进细胞增殖、迁移及侵袭，抑制细胞凋亡的内部机制，本研究通过双荧光素酶报告基因证实了PCK1为miR-498 的靶基因，且miR-498 可靶向负调控PCK1 的表达。PCK1 是调节糖异生过程中的限速酶，其能够广泛参与糖代谢、脂代谢、衰老、糖尿病以及肿瘤细胞增殖和凋亡等代谢和生物学进

程［16］。相关研究表明，PCK1 在肾透明细胞癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，PCK1 高表达组患者的总体生存率明显高于低表达组［17］；PCK1 过表达后可明显抑制肝癌细胞的迁移能力，而敲除后促进其迁移，说明PCK1 作为抑癌基因参与肝癌的发生和发展［18］；沉默PCK1 通过诱导氧化应激和转录因子Nrf2 的激活促进肝癌细胞的增殖［19］；过表达PCK1 通过激活糖异生和抑制糖酵解途径来降低肝癌细胞的活力，诱导细胞凋亡，并抑制细胞迁移［20］；circC3P1 通过海绵miR-4641 在肝癌细胞中促进PCK1 表达，进而抑制细胞的增殖、迁移与侵袭［21］。上述研究成果揭示了PCK1 在肿瘤中发挥着抑癌基因的作用，本研究结果与上述研究也是一致的，本研究结果显示，过表达或敲低miR-498 可引起PCK1 蛋白表达水平的显著下调或上调；PCK1 上调可显著减弱miR-498 mimics 对SCC-15 细胞增殖、迁移和侵袭能力的增强作用及对细胞凋亡的抑制作用；PCK1 下调可显著减弱antimiR-498 对SCC-15 细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用。提示miR-498 通过靶向抑制PCK1 的表达促进SCC-15 细胞增殖、迁移及侵袭，并抑制细胞凋亡。然而本研究仅仅在体外细胞水平上进行了探究，miR-498 对PCK1 的调控作用在体内水平上是否还具有类似的趋势，有待进一步探究。

综上所述，miR-498 通过靶向抑制PCK1 的表达促进SCC-15 细胞增殖、迁移及侵袭，并抑制细胞凋亡。但关于miR-498 调控PCK1 涉及的作用机制较为复杂，这将是本研究后续研究的重点。