李华玲，杨 迪，韦俊杰，陈章悦，陈菊萍

人体衰老的本质是细胞的衰老[1-2]，而衰老细胞的积累和癌症、糖尿病和神经退行性等疾病有关[3-4]。近年来发现有许多非编码RNA影响着控制衰老的通路[5-6]，其表达水平在衰老的过程中发生了改变并发挥着重要的调控作用。其中环状RNA结构较线性RNA更稳定，不会被核酸外切酶R所酶切，且有较强的组织表达特异性、时间和空间特异性以及疾病特异性，而环状RNA在衰老过程中的作用研究较少。

本课题组前期采用基因芯片技术，在衰老细胞中发现hsa_circ_0007113的下调明显，其亲本基因是泛素连接酶E3(HERC4)。HERC4 是近年来发现的一种E3 泛素连接酶，参与肺癌、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤的发生和发展[7-8]，对于其产生的环状RNA 的研究更是鲜有报道。因此，本研究通过基因工程手段构建环状RNA hsa_circ_0007113的真核生物表达载体，经过测序验证正确后，利用脂质体转染试剂转染人胚肾(HEK293T)上皮细胞，用qRT-PCR检测hsa_circ_0007113的表达，并转入人胚肺成纤维细胞IMR-90中，通过β-半乳糖苷酶染色和CCK-8检测细胞的衰老程度和增殖程度，为深入了解该环状RNA在衰老生物学中的功能提供了有力的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料HEK293T(人胚肾上皮细胞)、IMR-90(人胚肺成纤维细胞)为ATCC来源，购自南京科佰公司。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、DMEM培养基、Optium-Medium、双抗(青霉素及链霉素)均购自美国Gibco公司。KOD Plus Neo购自日本TOYOBO，T4 DNA Ligase、FastDigest Enzyme 购自美国Thermo Scientific。Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 购自北京TransGen Biotech。质粒小量抽提试剂盒(E.Z.N.A.® Endo-free Plasmid Mini Kit I (50))、DNA胶回收试剂盒(E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit)购自美国Omega，TRIzol试剂、RnaseR纯化试剂盒购自北京天根公司。逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自南京诺唯赞公司。过表达载体pLC5-ciR试剂盒购自广州吉赛生物公司。PCR 引物由上海生工合成。β-半乳糖苷酶检测试剂盒、CCK-8试剂盒购自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1hsa_circ_0007113序列全长的扩增 从circBase数据库(http：//www.circbase.org/)上查到环状RNA hsa_circ_0007113(circBank ID: hsa_circHERC4_012)的682 bp的全基因序列，引物序列为：(F) 5′-CCGAATTCAGATTGCTTGTGGACGAG CA-3′；(R)5′-TCCGGATCCAGGCCAAGCTGTCCAT CAGA-3′。(下划线为EcoRI和BamHI的双酶切位点，前边为保护碱基)。以细胞的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR 反应体系 50 μl: 10×PCR buffer foe KOD-plus-neo 5 μl，KOD-plus-neo 1 μl，上、下游引物(10 μmol/L) 各1.5 μl，MgSO4(25 mmol/L) 5 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 32 μl。PCR扩增条件：95 ℃ 预变性5 min；98 ℃ 变性 10 s，58 ℃退火 30 s，68 ℃延伸60 s，共35个循环；68 ℃延伸5 min。得到PCR产物后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。

1.2.2hsa_circ_0007113过表达载体的构建及鉴定 将回收的目的片段和pLC5-ciR载体分别用 EcoRⅤ、BamHI进行双酶切，保持37 ℃、1 h，然后用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，并回收目的条带。再用T4 DNA 连接酶连接目的片段和空载体质粒，在EP管中配置连接反应液，用移液枪吹打混匀，保持22 ℃、30 min，然后16 ℃过夜连接，构建重组表达质粒pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113。将连接产物转化感受态细胞Trans1 T1，在 LB 固体培养基(氨苄)中培养、筛选，挑选阳性单菌落，接种于 LB 液体培养基(氨苄)，37 ℃摇床培养6 h，以菌液为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳进行检测，用较亮目的条带的阳性菌液扩大培养，提取质粒，并进行双酶切验证，将成功切出目的条带的菌液加甘油保菌后送上海生工生物有限公司测序。测序引物为F: 5′-ACCAAGGAAGGTGGAGTGTT-3′ ；R: 5′-AGGCCAA GCTGTCCATCAGA-3′。将测序结果正确的重组质粒，用无内毒素的质粒大提试剂盒提取质粒，-20 ℃保存备用。

1.2.3细胞转染实验 采用脂质体转染方法，将处于对数生长期的HEK293T或IMR90细胞接种到6孔板中，观察细胞形态，待细胞覆盖率约(70～90)%时，在100 ul 无血清的Opti-MEM培养基中加入3 ug质粒DNA，柔和混匀；在100 ul不含血清培养基中稀释4 ul lipofectamine 2000转染试剂，轻柔混匀，室温放置5 min。二者混匀后静置20 min，加入无血清培养基的细胞孔中，轻摇混匀，培养(5～6) h后，更换完全培养基后，37 ℃培养待检测。另外将空载体转染组和未转染组分别设置为阴性和阳性对照。

1.2.4实时荧光定量法检测环状RNA表达效果 收集转染40 h后的细胞，以未经转染的细胞作为阴性对照组、转染重组质粒的细胞为过表达组，用TRIzol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，反应条件为：30 ℃、10 min；42 ℃、20 min；95 ℃、5 min。逆转录使用随机引物。以逆转录得到的cDNA为模板进行RT-qPCR，反应条件同前。

1.2.5β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 染色检测细胞衰老 将转染后培养40 h的IMR90细胞接种于新的6孔板，吸掉培养基，PBS缓冲液洗涤后，加入SA-β-gal染色固定液1 ml/孔，室温下静置固定15 min；吸除细胞固定液，用PBS洗涤3 min，洗涤3次；加入1 ml/孔染色工作液，37 ℃过夜孵育；第二天在光学显微镜下观察。蓝绿色为阳性细胞，阴性细胞不被染色；各组在显微镜下选取3个视野，计数细胞总数和SA-β-gal染色阳性细胞数，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。

1.2.6细胞增殖率测定 转染后培养40 h的IMR90细胞，以未经转染的细胞作为阴性对照组，以转染重组质粒的细胞为过表达组，稀释成密度为每微升500个细胞，然后以每孔4 μl共2 000个细胞接种至96孔板内，24 h后在光学显微镜下观察细胞生长情况。去除原始培养液，每孔加入10 μl CCK-8溶液和90 μl DMEM培养液。在含5% CO2饱和湿度的培养箱中孵育1 h，在450 nm处用酶标仪检测吸光度值。

2 结果

2.1 环状RNA hsa_circ_0007113过表达载体的构建及鉴定根据hsa_circ_0007113(circBank ID: hsa_circHERC4)的全长682 bp序列，以EcoRI(GAATTC)和BamHI(GGATCC)双酶切连接到修改的pLC5-ciR载体中，见图1。

图1 环状RNA hsa_circ_0007113 的全长序列及pLC5-ciR载体示意图

通过PCR扩增了hsa_circ_0007113的全长序列，经琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小约682 bp左右。将构建的重组体PCR鉴定后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带大小正确的进行回收条带并测序，测序峰图正常，无杂峰或叠带，进行测序分析后，阳性克隆测序结果显示，插入的序列和预期目的基因序列完全一致，见图2，红框中为目的基因序列，蓝框为部分成环框架序列(协助环状RNA成环)，说明成功构建重组的环状RNA表达载体。

图2 环状RNA hsa_circ_0007113 测序图

2.2 环状RNA hsa_circ_0007113反向剪接的示意图和测序鉴定环状RNA hsa_circ_0007113可以经过反向剪接，使HERC4基因的19号外显子5′末端连接到23号外显子3′端而形成环状结构。经过测序后，结果进一步证实这一结论，箭头左侧为HERC4基因23号外显子末尾序列，右侧为19号外显子的起始序列(图3)。

2.3 环状RNA hsa_circ_0007113过表达效果检测将重组体pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113 和空载体共转染HEK 293T细胞40 h后，收集细胞提取总RNA，进行RT-PCR 扩增。结果表明，与对照组(pLC5)相比，过表达组的hsa_circ_0007113表达量明显增高，表达量约为对照组的411倍，见图4A、B，说明hsa_circ_0007113能在真核细胞中成功高效表达。

图3 环状RNA hsa_circ_0007113 反向剪接位点经sanger 测序验证

2.4 环状RNA hsa_circ_0007113过表达的功能检测

2.4.1过表达环状RNA hsa_circ_0007113对IMR-90细胞衰老的影响 pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113过表达组的β-gal染色阳性率为(32.6±0.031)%，而对照组阳性率是(46.1±0.071)%，见图5，差异有统计学意义(P<0.01)，说明过表达环状RNA hsa_circ_0007113减轻细胞的衰老程度。

图5 SA-β-gal 染色检测过表达hsa_circ_0007113对IMR90细胞衰老的影响 SPX200

2.4.2过表达环状RNA hsa_circ_0007113对IMR-90细胞增殖的影响 pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113过表达组细胞CCK8检测的OD值为(1.537±0.071)，与空白对照组(OD值0.687±0.050)比较，见图6，差异有统计学意义(P<0.05)。说明pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113过表达组的细胞增殖活力高于对照组，hsa_circ_0007113对IMR-90 的增殖产生促进作用。

图6 CCK8法检测pLC5_circ_0007113过表达对IMR90细胞增殖的作用与对照组比较：*P<0.05

3 讨论

蛋白酶体降解途径在细胞周期和细胞免疫反应等众多细胞过程中起着重要作用。不适当的泛素介导的蛋白质降解与衰老也有密切关联。USP 3是泛素特异性蛋白酶家族的成员之一。USP3 能够去泛素化并稳定 p53，同时促进正常细胞转化[9]，有研究发现其环状RNA，circUSP3的表达量与衰老有明显联系。还有报道发现一种 E3 泛素连接酶，Parkin具有潜在的抗衰老的作用[10]。E3泛素连接酶，能够使一系列其底物蛋白泛素化并通过蛋白酶体进行降解，多年来的实验研究发现可能正是由于E3泛素连接酶基因的突变或异常，导致其底物蛋白的非正常累积，对细胞产生极大的毒性，最终导致细胞的死亡，这可能是细胞衰老的原因之一，因此研究E3泛素连接酶HERC4及其所产生的环状RNA的性质对于揭秘衰老有着重要的意义。

目前，对于泛素连接酶HERC4 所产生的环状RNA 仅被检测出，并没有详细报道，因此本文在实验室的前期Arraystar 芯片筛选的与衰老相关的环状RNA中，最先关注了来源于HERC4基因的环状RNA hsa_circ_0007113，同时研究分析了环状RNA hsa_circ_0007113的基本特征以及成功构建了hsa_circ_0007113的过表达载体。通过数据库比对，hsa_circ_0007113是由HERC4( NM_022079)的19、20、21、22、23号外显子经过反向剪接而成，剪切点前后的序列分别是AG和GT，这正符合环状RNA产生的剪切规律。经过对hsa_circ_0007113反向剪切位点的测序验证，说明hsa_circ_0007113确实首尾相接(首AGCAGGTTCGTTG、 尾GCAGGTGTTCG)，成环正确。经过对 hsa_circ_0007113 全长序列的扩增及测序验证，说明成功构建了过表达的环状RNA，pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113，并在HEK293T 细胞中高效表达。

在确定hsa_circ_0007113 成功过表达后，本研究进一步通过转染将hsa_circ_0007113过表达载体和空载体转染至IMR90细胞中，研究其对细胞的衰老过程和增殖的影响，结果显示，过表达hsa_circ_0007113后，细胞的增殖增加，抑制了衰老。

近年来，在多种组织和细胞系中发现了许多的环状RNA，而对于 circRNA 的研究热点主要集中在肿瘤领域[11-12]，在衰老及衰老引起的疾病中的研究较少，目前仅有少量与衰老相关的环状RNA的研究，如Circ-Foxo3、CircPVT1 CircCCNB1 在衰老的过程中发挥一定的调控作用[13-15]。本研究发现了一个来源于HERC4 基因的环状RNA 的新的功能，在人肺成纤维细胞中进行了功能验证，并证实了其与衰老的关系，其具体分子机制有待进一步探讨。环状RNA 的作用机制，目前最常见的是作为“miRNA海绵”的吸附体，通过Ago2与miRNA竞争性结合，调控基因表达，经过生物信息学分析，hsa_circ_0007113与 miRNA-515-3p、miRNA-519存在作用靶点(MREs)，而这2个miRNA是P53/P21衰老通路的重要因子，课题组将进一步研究其功能。

本研究首次将环状RNA hsa_circ_0007113的序列连入pLC5真核表达载体，利用脂质体转染HEK293T细胞，成功地使pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113 在HEK 293T 细胞中转录表达，并在IMR90 细胞中进行了初步的功能验证。证实了其与衰老的关系。因此，为后续研究hsa_circ_0007113 的功能和机制奠定了基础。