邹锐涛 蔡桂月 陈晓旋 肖 铿 樊志金 陈嵘祎

1广东医科大学，广东广州， 523024；2南方医科大学皮肤病医院，广东广州，510091

恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是起源于黑素细胞的一种恶性肿瘤，具有侵袭性强，如不及时治疗预后差等特点[1]。在现阶段，MM常规治疗的疗效不佳，其中手术仅对早期治疗有效。近年来，免疫治疗在MM中发挥着越来越重要的角色。目前，应用在MM中的免疫治疗主要有：免疫检查点抑制剂(PD-1和CTLA-4等单克隆抗体)；细胞因子(IL-2，IFN-α-2b等)；溶瘤病毒(溶瘤病毒T-VEC)；肿瘤疫苗(肽疫苗、DC疫苗等)；过继性细胞疗法(肿瘤浸润淋巴细胞疗法、工程T细胞受体治疗、嵌合抗原受体T细胞疗法、NK细胞疗法等)[2]。其中，过继性细胞疗法是近几年来在肿瘤免疫治疗中的一大热点。

过继性细胞疗法(adoptive cell therapy，ACT)是通过收集患者体内的免疫细胞，经过体外激活或基因修饰，扩增至足够数量时并选择具有肿瘤靶向的免疫细胞，再回输到机体从而起到抗肿瘤的一种新型的免疫治疗方法[3,4]。这些免疫细胞可来源患者外周血淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)或淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activated killer cell, LAK)。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)是对外周血中淋巴细胞进行磁珠分选T细胞后再进行基因编辑成CAR-T，对于肿瘤治疗具有精准、快速、高效，但对于实体瘤的治疗效果欠佳，在MM治疗中的研究较少；TIL是从肿瘤组织中提取出来的，这类淋巴细胞具有精准识别肿瘤细胞的能力，能够有效地杀伤肿瘤细胞，对于转移性黑素瘤具有较好的治疗效果[5-7]。但是TILs量少，分离困难，很多情况下是功能耗竭的，无法发挥正常的抗肿瘤作用，发展新的淋巴细胞来源具有重要意义。

本研究通过构建黑素瘤小鼠模型，提取荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞，与黑素瘤细胞共培养，发现与正常脾脏淋巴细胞相比，来自黑素瘤小鼠的脾脏淋巴细胞具有更明显的抑瘤现象，通过对两组淋巴细胞进行活化刺激，也发现黑素瘤小鼠来源的脾脏淋巴细胞分泌更高的肿瘤杀伤因子。脾脏淋巴细胞易获取、数量多，这一研究发现或许为MM的过继性细胞疗法提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和实验动物 黑素瘤细胞系B16购自上海盖宁生物科技有限公司，雌性C57BL/6小鼠，SPF级，购自广东省医学实验动物中心；在南方医科大学动物伦理委员会指导下进行。

1.1.2 实验试剂 北美胎牛血清、1640培养基、0.25% Trypsin-EDTA (1X)0.25% Trypsin-EDTA (1X)胰酶(美国Gibco公司)；PD-1、Granzyme B、perforin、GAPDH一抗、β-actin一抗(美国Cell Signaling Technology公司)；Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8、PE-抗小鼠CD4、PE-cy7抗小鼠Granzyme B、PE-抗小鼠perforin单克隆荧光抗体(美国Biolegend公司)； CCK8试剂盒(同仁化学/DOJINDO)；Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、山羊抗兔二抗、BCA蛋白浓度测定试剂盒、红细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司);刀豆蛋白A、Hass缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；TNF-α、IFN-γ ELISA试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠黑素瘤细胞系B16，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的1640培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，长至70%～80%时，使用胰酶消化后传代以及液氮冻存保种。

1.2.2 荷瘤小鼠模型构建 B16细胞长至70%～80%时，胰酶消化后加入2 mL培养基重悬，离心5 min，去除上清，PBS清洗后用1 mL PBS重悬，计数，细胞量稀释至106/150 μL，小鼠背部备皮，每只每个部位注射150 μL，观察3周。

1.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞提取 荷瘤小鼠建模3周后，肿瘤长至7～8 mm时，将正常小鼠与荷瘤小鼠进行解剖，取其脾脏剪碎置于Hass缓冲液中进行研磨，70 μm细胞筛过滤，使用淋巴细胞分离液进行提取，加入2 mL红细胞裂解液裂解5 min，离心并用PBS清洗后，使用1 mL完全培养基重悬，计数、备用。

1.2.4 Western blot 用刀豆蛋白A(ConA)5 μg/mL对淋巴细胞进行刺激，即将脾脏淋巴细胞分四组：正常小鼠脾脏淋巴细胞(NL)、肿瘤小鼠脾脏淋巴细胞(ML)、NL+ConA、ML+ConA，每组细胞数为2×106，铺板刺激24 h，收集细胞，每组用200 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min，离心收集上清进行BCA蛋白定量，加1/4的5×loading buffer混匀后100℃金属浴10 min，每组取20 ug蛋白进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉进行封闭1 h，TBST漂洗三遍，分别与PD-1、Granzyme B、perforin、GAPDH、β-actin等蛋白一抗(1∶1000)于4℃敷育过夜，TBST漂洗三遍后，加入二抗(1∶5000)室温敷育1h，TBST漂洗三遍后进行ECL 化学发光剂显色，Image J分析软件计算各组细胞目的蛋白的相对表达量。

1.2.5 ELISA 对上述分组细胞铺板刺激后离心收集上清，进行TNF-α、IFN-γ ELISA测定。严格按照说明进行检测，检测完成后，10 min内进行酶标仪测量每孔在450 nm发射波长下的吸光度值，标准曲线R2控制在0.998以上，根据标准曲线计算出TNF-α、IFN-γ表达水平。

1.2.6 Calcein/PI荧光染色 收集B16细胞进行24孔板铺板，每孔10万个细胞，4 h细胞贴壁后分3个组，每组3个复孔，即阴性对照组、正常组(NL组)、荷瘤组(ML组)，按照1∶20(B16细胞：NL/ML)加入淋巴细胞，37℃、5% CO2培养箱中共培养24 h，去上清，PBS漂洗2遍，加入Calcein AM/PI染色液(1∶500)，每孔200 uL，37℃、5% CO2培养箱避光孵育30 min，荧光显微镜观察。

1.2.7 CCK8 收集B16细胞进行96孔铺板，每孔10000个细胞，4 h细胞贴壁后共分为7个组、每组6个复孔。即空白组(无细胞)、阴性对照组、ConA 组、NL组、ML组、NL+ConA组、ML+ConA组，按照1∶20(B16细胞：NL/ML)加入淋巴细胞，ConA 5 μg/mL刺激24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液后，37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h,进行酶标仪测量每孔在450 nm发射波长下的吸光度值。

1.2.8 流式细胞术 取提前备好的NL/ML各106，分别用100 μL 1×的结合缓冲液重悬，每管分别加入5 μL的Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8、PE-抗小鼠CD4流式抗体，4℃避光孵育20 min；而ConA刺激24 h后的NL/ML，分别用100 μL 1×的结合缓冲液重悬，每管分别加入5 μL的Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8，4℃避光孵育20 min，漂洗后对细胞进行破膜，分别加5 μL PE-cy7抗小鼠Granzyme B、PE-抗小鼠perforin流式抗体，4℃避光孵育20 min，每管再加1mL缓冲液漂洗，离心后用500 μL 1×的结合缓冲液重悬，用流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法 本研究使用Image J和GraphPad Prism 8.0进行制图以及实验数据的统计分析，两样本间采用配对样本t检验。检验水准α=0.05，P<0.05，表示差异具有统计学意义。所有实验结果均重复3遍以上。

2 结果

2.1 B16细胞分别与NL/ML共孵育24 h后各组B16细胞的增殖能力以及Calcein AM/PI荧光染色后的结果 NL和ML按照20∶1，分别与B16细胞共孵育24 h后，ML组与阴性对照组以及NL组相比较，B16细胞增殖能力均显著下降，差异具有统计学意义(*t=39.07，*P<0.05；#t=9.39，#P<0.05，图1a); Calcein AM/PI荧光染色后的结果也与之对应，并且NL与ML都依附在B16细胞表面(图1b)。

*P<0.05：与阴性对照组比较，# P<0.05：与正常组比较

2.2 B16细胞分别与NL/ML共孵育并加入ConA刺激24 h后各组B16细胞的增殖能力 B16 细胞按比例1∶20与NL/ML共孵育并加入ConA(5 μg/mL)刺激24h后，ConA组细胞增殖能力相对于阴性对照组无差异，排除ConA对于B16细胞的影响；ML组与阴性对照组以及NL组相比较，B16细胞增殖能力均显著下降(*t=69.61，*P<0.05；#t=5.44，#P<0.05，图2)。

2.3 NL组和ML组脾脏淋巴细胞中CD8+、CD4+T细胞比例占比 流式分析发现，在免疫T细胞表达CD3阳性条件下， NL组,中CD8+和CD4+T细胞比例分别为：25.1%、59.9%；在ML组中CD8+和CD4+T细胞比例分别为：31.3%、58.9%。ML组中CD8+T细胞明显高于NL组中CD8+T细胞，差异具有统计学意义(t=11.56，P<0.05，图3)。

图2 CCK-8法检测细胞增殖能力 *P<0.05：与阴性对照组比较，# P<0.05：与正常组+刀豆蛋白A比较 图3 流式细胞术分析NL和ML中CD8+与CD4+比例占比 *** P<0.001

2.4 NL组和ML组PD-1蛋白表达水平 与正常小鼠脾脏淋巴细胞NL组相比，B16荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞ML组中PD-1蛋白表达水平显著下调; 在ConA(5 μg/mL)刺激活化24 h后， ML组PD-1蛋白表达水平依旧较NL组显著下调(图4)。

图4 Western blot检测NL、ML、NL +ConA和ML+ConA中 PD-1蛋白表达水平

2.5 在ConA刺激24 h之后，NL组和ML组淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素蛋白表达水平以及TNF-α、IFN-γ细胞因子表达水平。

在ConA(5 ug/mL)刺激活化24 h后，ML组中颗粒酶B、穿孔素蛋白表达水平较NL组显著上调(图5a)；TNF-α、IFN-γ细胞因子的表达水平都较NL组都显著上升(t1=22.72，P1<0.05；t2=11.56，P2<0.05，图5b)；ML组中CD8+T细胞的颗粒酶B表达比例相对NL组更高，ML组(17.8%)较NL组(14.3%)提高了24.5%；而穿孔素的表达比例，ML组(11.3%)较NL组(8.78%)提高了28.7%，(图5c、5d)，而未经ConA刺激的淋巴细胞几乎不表达颗粒酶B以及TNF-α、IFN-γ细胞因子。

****P<0.0001；***P<0.001

3 讨论

MM极易发生侵袭且早期即可发生转移，常规治疗的疗效不理想，但MM是对免疫治疗相对敏感的恶性肿瘤，近几年免疫治疗在MM中的应用已经取得重大发展。免疫检查点抑制，特别是抗 PD-1 免疫疗法已经彻底改变了MM的治疗，美国 FDA 批准的免疫治疗药物 Pembrolizumab(PD-1抗体)/CTLA-4 抗体等用于治疗MM能明显延长欧美MM患者的生存时间[8,9]。PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子。肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2,导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞[10-12]。有研究发现，PD-1的相对水平与T细胞产生细胞因子的能力呈负相关，在PD-1上调的T细胞中发现TNF-α、IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌功能受限[13]。Beane等[14]利用锌指核酸酶针对编码PD-1基因，敲低TIL中PD-1的表达，发现敲低PD-1的TIL体外效应功能得到改善，TNF-α、GM-CSF和IFN-γ等多功能细胞因子显著增加，在治疗转移性黑素瘤上也取得可观的效果，并且对机体不产生不利影响。有研究发现，体外刺激后，PD-1缺陷T细胞的IFN-γ分泌和细胞毒能力增加[15,16]。而TNF-α、IFN-γ在MM中发挥着重要作用，TNF-α在体内或体外均有杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的作用。IFN-γ具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调控的作用，对于TNF-α具有刺激作用，增强抗肿瘤效应[17,18]。

PD-1虽然存在诱导表达的现象，即在活化的T淋巴细胞上高表达，但在正常的脾脏淋巴细胞中同样也表达PD-1[19],本实验研究发现ML中PD-1表达水平较NL显著下降，在ConA刺激24 h后，ML组中PD-1表达依旧较NL组中显著下降。并且在经过ConA刺激24 h之后，ML组中的TNF-α、IFN-γ表达水平均明显高于NL组(P<0.05),并且在CCK8细胞活力实验结果表明，NL和ML均具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，但ML的抑制作用比NL更显著，在ConA刺激下，也证明了这一结果。这提示ML功能可能在肿瘤微环境中不易被抑制，并且分泌更高的细胞因子从而起到更好的杀伤肿瘤细胞的效果。

穿孔素是储存在细胞毒性T细胞(CTL)和NK细胞胞质的细胞毒颗粒中的糖蛋白，颗粒酶是CTL和NK细胞释放的细胞浆颗粒[20,21]。有研究表明，肿瘤免疫激活的CD8+T细胞主要通过穿孔素颗粒酶-和Fas/Fas配体-途径诱导细胞死亡来执行肿瘤清除[22], 本研究在CD3阳性分选情况下，通过流式分析发现，NL组中CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞比例分别为：25.1%、59.9%；在ML组中CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞比例分别为：31.3%、58.9%，其中ML组中CD8+T淋巴细胞比例占比明显高于NL组中CD8+T淋巴细胞(P<0.05)。而CD4+T细胞在两组中差异不大。并且在Western blot中发现，ML组中穿孔素的表达水平较NL组显著上升(P<0.05)，而颗粒酶B在未激活的免疫细胞是不表达的；使用ConA刺激24 h后，ML组中穿孔素、颗粒酶B的表达水平也较NL组显著上升(P<0.05)；流式分析发现ConA刺激24 h后，ML组中CD8+T细胞表达的颗粒酶B的比例也相对NL组更高，ML组(17.8%)较NL组(14.3%)提高了24.5%；而穿孔素的表达比例，ML组(11.3%)较NL组(8.78%)提高了28.7%。这也提示，ML相对于NL具有更强的抗肿瘤作用。

综上所述，黑素瘤小鼠的脾脏淋巴细胞具有更明显的抑瘤效应，可能通过低表达PD-1以及能够分泌更高的穿孔素、颗粒酶B以及TNF-α、IFN-γ等而实现。作为初步探究，我们在本研究中并未对这种现象是否具有特异性的进行验证，我们将在后面的研究中进行跟进。并且仅在细胞层面得出结论，仍需通过动物实验进一步验证。由于脾脏淋巴细胞易获取、数量多，希望这一研究发现能为MM的过继性免疫治疗提供新的思路。