杨蓓蓓 武卫民 肖 华

1福建医科大学附属第一医院，福建福州，350005；2郴州市第一人民医院皮肤科，湖南郴州，423000

单纯性大疱性表皮松解症(EBS)是一种遗传性皮肤脆性疾病，属常染色体显性遗传。多数于出生后数天或数月发病。皮损好发于手足以及其他受压和摩擦部位。愈后遗留色素沉着，但不留瘢痕。本病常持续终生，部分患者青春期后症状改善。EBS的致病主要是由于编码表皮和基底膜带的角蛋白K5和K14的基因突变。迄今为止，在EBS各亚型患者中，已报道260多种K5和K14基因突变。本研究中，收集到一家系并通过全基因组外显子测序和Sanger测序确定了KRT5基因的一个新的突变位点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患者，女，1.5岁。因“全身红斑、水疱1年余”就诊。患者生后2月余，双侧手足反复出现红斑、 水疱，水疱愈合后未出现瘢痕。体格检查：一般情况良好。皮肤科检查：颈部、双腋下、腹部、腹股沟、四肢关节及双足可见大小不一环状红斑，边缘区可见散在绿豆至蚕豆大水疱，部分疱壁紧张，部分疱壁松弛，水疱消退后不留瘢痕，愈合后伴有褐色色素沉着(图1)，无指甲、毛发及黏膜受累，双掌跖未见角化性皮疹。实验室检查：血、尿、粪常规正常，肝肾功能、电解质、微量元素、免疫球蛋白及补体、自身抗体谱均正常。患者父亲诉5岁前在皱褶部位有红斑水疱等皮损，未予处理，5岁后皮损基本自愈，患者父亲皮肤科检查无异常。皮肤组织病理：表皮内疱(图2)。免疫荧光dsg1、dsg3、BP180、BP230均阴性。

图1 腹部、腹股沟、四肢关节及双足可见大小不一环状红斑，边缘区可见散在绿豆至蚕豆大水疱,水疱消退后不留瘢痕，愈合后伴有褐色色素沉着 图2 表皮内水疱 (HE,×100)

图3 患者基因检测结果

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 患儿父母签署知情同意书后，抽取患儿及其父母外周血各2mL，收集于EDTA抗凝管中。

1.2.2 基因组DNA提取 采用常规方法提取DNA，使用核酸浓度测定仪 NanoDrop2000进行标本DNA浓度及纯度测定。

1.2.3 高通量测序及Sanger测序验证 样本送检至诺禾致源基因检测公司进行高通量测序，通过IIIuminalHiSeq 6000平台对基因组文库进行高通量、高深度测序。使用TRIMMOMIC v0.38软件对检测到的变异进行过滤，设计引物并对突变位点进行Sanger测序验证，对筛选出的突变位点所在的基因序列区域进行PCR扩增，应用primer 5.0设计引物序列：KRT5-F：TGTAAACGACGGCCAGTAAGGGGGTCCAGTAGAGT-GC，KRT5-R：CAGGAAACAGCTATGACCATTTGACG-CTGGAGCTGCTA。扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。扩增结束后，PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化后，直接在一代测序仪上测序，测序结果与KRT5基因参考序列进行分析比对。

2 结果

注释后的结果显示：该患者及其父亲KRT5基因外显子9(移码缺失c.1653_1654delCT)发生了突变(图3)，通过Sanger测序对KRT5的新突变进行验证，结果显示：该患者及其父亲携带同一突变(KRT5 c.1653_1654delCT)，其母亲未发现该突变。患者诊断为伴移行性环状红斑的单纯性大疱性表皮松解症(EBS-Migr)。

3 讨论

单纯性大疱性表皮松解症(EBS)是一种较为少见的遗传性皮肤脆性疾病，极小的创伤即可引起水疱形成，其特征在于表皮内水疱[1]。KRT5和KRT14是角质形成细胞中间丝蛋白的重要组成部分，对于维持基底层角质形成细胞的结构稳定和抗张力具有重要意义[2]。大多数EBS病例(75%)源于KRT5或KRT14基因的突变[3]。EBS伴有移行性环状红斑(EBS-Migr)是EBS的一种罕见亚型，其特征为环状红斑，伴有水疱形成和愈合后色素沉着。根据报道：KRT5中c.1649delG的杂合突变是导致EBS-Migr的特异性突变[4]。然而，根据既往报道，相同的突变会导致EBS的另一种罕见亚型：EBS伴有斑驳样色素沉着(EBS-MP)[5]。既往报道指出了EBS-Migr相关的KRT5外显子9的突变(c.1637del4[6],c.1638_1641del-CTAG[7],c.1649delG[4,8,9], and c.1650delC[10])。本研究中，我们收集到一家系并通过二代测序确定了KRT5基因的新突变：c.1653_1654delCT的杂合突变。

KRT5基因突变在EBS发病中起着十分重要的作用。KRT5为中间丝蛋白的重要组成部分，主要表达于表皮基底细胞层中，最终构成细胞骨架，使表皮基底细胞与基底膜带连接紧密[11]。KRT5基因的细胞遗传学位置为12号染色体长臂(12q13.13)。在大疱性表皮松解症患者中已发现超过130个KRT5基因突变，这导致皮肤脆性增加及水疱形成。

当环境因素(主要是外部创伤)触发时，突变类型及其在mRNA和蛋白质水平上的表达水平决定了该疾病表型谱的总体严重程度[12]。KRT5的mRNA和蛋白质水平在EBS患者细胞中没有降低[13]，移码突变可能由于异常的尾部区域延伸而干扰正常的蛋白质折叠。

KRT5敲除小鼠模型的转录组分析显示EBS患者病变皮肤内IL-6和IL-1β的表达升高，免疫组化研究表明炎症细胞和分子浸润[14]。双醋瑞因(下调IL-1β的小分子)的局部应用已被证明可以稳定角蛋白中间丝并减少重度EBS患者的水疱[15]，表明EBS发病与炎症相关。

c.1653_1654delCT的碱基缺失突变导致KRT5的C肽端缺失，表明C端框架移位有助于产生EBS-Migr在婴儿期特征性的炎症表型，这可能触发了免疫反应[8,16]。该表型的潜在机制仍需进一步研究。

EBS的病理学机制从结构蛋白扩展到酶、信号受体、囊泡转运蛋白和泛素化等[12]。这些类型的病理学不是EBS独有的，因此，其他遗传疾病疗法的进步很可能为EBS治疗打开新的思路。