邬静 林针懿 张叶 刘乐 郭璁 叶蓓蕾 黎维诗 凌鹏

1. 海南大学热带特色林木花卉遗传与种质创新教育部重点实验室，海南海口  570228;2. 海南博大兰花科技有限公司，海南海口  570311

摘  要：对204株菲律宾火焰兰（ ）组织培养衍生群体的26个主要表型性状和遗传多样性水平进行调查与分析，并利用ISSR分子标记对该群体的遗传多样性进行验证。结果表明：7个外观株型性状的遗传多样性指数为1.85，19个花部数量性状的遗传多样性指数为1.87。通过主成分分析，提取了7个主成分，累积贡献率达67.887%，其中導致菲律宾火焰兰群体中个体存在差异的主要性状有所有花枝是否同面、花瓣厚度等。对基于表型性状的数据进行聚类分析，204株菲律宾火焰兰组织培养群体被分为5大类群：第Ⅰ类群有78株，主要特点表现为叶片数多;第Ⅱ类群包含11株，主要特点为花序有较多的分叉数和花朵数;第Ⅲ类群包含31株，主要特征表现为花序的第一分枝的长度和叶长小于其他类群;第Ⅳ类群包含70株，主要特征是蕊柱的长度和宽度均小于其他类群;第Ⅴ类群有14株，主要特征为花梗直径和中萼宽度均大于其他类群。通过ISSR分子标记对该群体的遗传多样性进行验证，结果显示，2对ISSR分子标记引物在24株群体样本中共扩增出了17条多态性条带，平均每对引物扩增出8.5条多态性条带。该研究结果为火焰兰的品种改良提供了重要的遗传资源信息。

关键词：菲律宾火焰兰;表型性状;组织培养衍生群体;ISSR;遗传多样性

中图分类号：S602      文献标识码：A

Phenotypic Identification and Genetic Diversity Analysis of Tissue Culture Derived Population of

WU Jing， LIN Zhenyi， ZHANG Ye， LIU Le， GUO Cong， YE Beilei， LI Weishi， LING Peng

1. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Hainan Boda Orchid Technology Co.， Ltd.， Haikou， Hainan 570311， China

26 phenotypic traits of 204 plants of population derived from tissue culture were studied to understand the genetic diversity levels of the tissue culture population. Molecular makers such as ISSR markers were used in the study. The results showed that the genetic diversity index of 7 morphological traits was 1.85， and 19 quantitative traits of flower part diversity index was 1.87. The principal component analysis showed that there were 7 principal components of a cumulative contribution rate 67.887%. The main traits leading to the differences among the individuals were whether all flower branches were on the same surface or on the different faces， the thickness of petal， the length of lateral branch， the length of column bearing stamens and pistils， the width of middle calyx， thenumber of lateral branch， and the number of leaf. Cluster analysis on the data of phenotypic traits revealed that the 204 plants were divided into different four groups. Group I consisted of 78 plants， which had much more leaves. Group II contained 11 plants， which had more branches and flowers. Group III had 31 plants， which had shorter first inflorescence branch and shorter leaf length. Group IV contained 70 plants， which had much shorter and narrower style. Group V contained 14 plantswhich had larger pedicel diameter and wider calyx. ISSR markers were used to confirm the result from cluster analysis， and the results showed that 17 polymorphic bands were amplified by 2 pairs of ISSR primers on 24 plants， on average there were 8.5 polymorphic bands amplified by each pair of primers. The research results would provide a new way to seek genetic variation and an important genetic resource in variety improvements.

; phenotypic trait; tissue culture derivation; ISSR; genetic diversity

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.008

火焰兰（ Lour.）又称肾药兰、火星花、红珊瑚兰，属兰科火焰兰属，主要分布于我国海南、广西等地。火焰兰的花色鲜亮艳丽且花形奇特，喜高温高湿气候，目前被广泛用于切花、布景、绿篱和制作盆栽等，具有很高的园艺园林应用价值。近年来，火焰兰类的切花产品在国内各地的兰展中屡屡出现，国内市场潜力巨大。兰花的重要表型性状对其市场经济价值的提升和开发具有极其重要的作用。因此，开展火焰兰重要表型性状的评估与机制研究非常有必要且具有重要的意义。

我国有3个火焰兰原生种，分别为云南火焰兰（）、火焰兰（）和中华火焰兰（），自然分布于海南、云南和广州等地。国内对火焰兰的研究基础非常薄弱，其中华南植物园已收集了火焰兰属种质资源90多份，并且建立了火焰兰种质资源圃。近年来，有关火焰兰的报道主要涉及远缘杂交育种、种质资源评价、群体分布现状、离体快速繁殖、高通量转录组测序分析等，目前国内也已开展利用本土的3种火焰兰原生种种质资源的杂交育种研究。

目前，国内火焰兰可用作种质资源研究的材料仍较少，且植株自身对环境要求比较高，存在区域限制，火焰兰种质资源样本尤为稀缺。因此，本课题组通过对菲律宾火焰兰的组织培养衍生群体进行连续观察，结果发现其中个体之间在许多性状上存在明显的多样性，为了更好地描述和评价该原生群体中存在的性状多样性，同时探索利用这些性状多样性在火焰兰种质创新和新品种培育中的应用，本课题组决定以该火焰兰群体开展性状多样性调查研究，为今后开展火焰兰属乃至兰科植物的遗传多样性分析、种质资源评价、遗传图谱的构建及遗传育种等提供理论依据。

  材料与方法

  材料

供试的材料是利用原种菲律宾火焰兰差异较大的不同个体经组织培养无性繁殖后获得的混合群体，共204株，均取自于海南博大兰花科技有限公司东山基地种质资源圃（110°14′33.1″E，19°47′29.7″N）。供试群体的表型数据测量、整理结束后，对数据进行性状统计，后作正态分布图，从曲线两端分别取9株，中心均数处取6株，共从供试材料中筛选出24株表型性状具有代表性的火焰兰单株进行ISSR-PCR亲缘关系分析。

 方法

1.2.1  表型数据测量方法  从2020年9月至2021年5月连续观测2个花期，分别调查了中萼长与宽（MSL、MSW，mm）、侧萼长与宽（SL、SW，mm）、花瓣长与宽（PetL、PetW，mm）、唇瓣长与宽（LipL、LipW，mm）、蕊柱长与宽（GL、GW，mm）、花瓣厚度（PT，mm）、花朵数（NF）、分叉数（BN）、第一分枝至基部长度（BB，cm）、侧枝数（NLB）、侧枝长度（LBL，cm）、花枝长度（LFB，cm）、花梗直径（FPD，mm）、脱苞数（NEB）、所有花枝是否同面（SS）、叶片数（NB）、叶片厚度（BT，mm）、叶长（LeL，mm）、叶宽（LeW，mm）、株高（PH，cm）、株幅（PlW，cm）等26个表型性状。使用游标卡尺（AIRAJ 0～150 mm，精度0.01）、卷尺等测量工具测取数据并记录，所有性状数据均为2个连续花期调查的平均值。

1.2.2  DNA提取  取新鲜、幼嫩的火焰兰叶片，采用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（无锡百泰克生物技术有限公司）进行提取，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和纯度，稀释至10 g/μL，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.3  引物筛选及ISSR-PCR分析  供试引物为加拿大哥伦比亚大学公布的第9套ISSR通用引物，ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR的反应体系为：DNA模板1 μL，2×Es Master Mix（Dye） 10 μL，引物1 μL，加ddHO 8 μL。反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s，38/49℃退火45 s，72℃循环2 min，循环40次;72℃延伸7 min，最后4℃保存。

1.2.4  琼脂糖凝胶电泳检测  取PCR產物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测，100 V电压下35 min电泳，待电泳结束后在凝胶成像系统（BIO-RAD GelDoc XR+全自动凝胶成像系统，型号Universal HoodⅡ）上进行拍照保存。

  数据处理

表型性状的数据用Microsoft Excel 2010进行处理，计算最小值、最大值、极差、平均值、标准差、变异系数和多样性指数。多样性指数采用Shannon-Wiener多样性指数（H′）方法计算，将所有表型性状数据的平均值和标准差划分为10个等级，每0.5σ为一级，σ为标准差。通过SPSS 22.0软件对数据进行主成分分析、相关性分析，用RStudio软件进行聚类分析。

为进一步分析群体的遗传多样性，对不同分子量的PCR产物进行统计分析，根据每个引物在各样品中扩增出来的基因位点进行统计，扩增出条带的标记为1，未扩增出条带的标记为0，将所有表型性状数据输入Excel中，创建数据矩阵，然后通过NTSYSpc 2.10e软件进行聚类分析。

  结果与分析

  外观株型形态特征比较

由表1可知，火焰兰受测群体的外观株型呈现出差异形态，主要表现为所有花枝是否同面、叶片数、叶片厚度、叶长、叶宽、株高、株幅的平均值分别为1.81、35.75、1.60 mm、97.98 mm、39.66 mm、112.54 cm、45.10 cm;在群体内性状多样性指数范围为0.80～2.07，其中叶长性状多样性指数最高，所有花枝是否同面性状的多样性指数最低。对变异系数的分析结果表明，除叶长外，其余各性状的变异系数均大于10%。其中所有花枝是否同面的变异系数最大，达20.44%，其次为叶片厚度（16.88%）、株幅（16.16%），而叶长（8.71%）和叶宽（10.56%）的最小。

 花部數量性状特征比较

火焰兰受测群体的中萼长与宽、侧萼长与宽、花瓣长与宽、唇瓣长与宽、蕊柱长与宽、花瓣厚度、花朵数、分叉数、第一分枝至基部长度、侧枝数、侧枝长度、花枝长度、花梗直径、脱苞数等19个花部数量性状多样性分析结果如表1所示，其整体变异系数范围较大，除了中萼长、侧萼长与宽、花瓣长与宽、唇瓣长、蕊柱长外，其余性状变异系数均大于10%。其中，侧萼长的变异系数最小（6.25%），其次为中萼长（6.35%），脱苞数的变异系数最大（181.02%），其次为花瓣厚度（35.29%），平均变异系数为23.52%。遗传多样性指数最大的为侧枝长度（2.07），其次为中萼长、侧萼长、第一分枝至基部长度，均为2.05，遗传多样性指数最小的为侧枝数（0.62）。这表明火焰兰群体主要观赏性状多样性丰富且水平较高，具有较为丰富的变异，具有一定的品种改良空间和潜力。

  性状相关性分析

对火焰兰受测群体的26个表型性状进行相关性分析，结果表明，大部分表型性状之间存在显著或者极显著相关性（表2）。如所有花枝是否同面与分叉数、株高呈极显著正相关（<0.01）;花枝长度与花梗直径、株幅、株高、第一分枝至基部长度、花朵数、侧枝长度、中萼长、侧萼长、花瓣宽呈极显著正相关（<0.01）;花枝长度与花瓣长、叶长、叶片数呈显著正相关（<0.05），与花瓣厚度、叶片厚度、侧枝数呈极显著负相关（<0.01），同时与蕊柱宽呈显著负相关（< 0.05）;花梗直径与叶片厚度呈显著正相关（< 0.05），与侧枝数呈极显著负相关（<0.01），其次除了分叉数、第一分枝至基部长度、花朵数、花瓣厚度、唇瓣长、蕊柱长、叶片数之外，均呈极显著正相关（<0.01）。

 主成分分析

对火焰兰受测群体的26个表型性状进行主成分分析（表3），结果表明，前7个主成分所对应的特征值均大于1，累计贡献率达67.887%，表明前7个主成分基本可反映原始因子代表的大部分信息。其中，第1主成分的特征值为6.392，其方差贡献率最大（24.586%），占主导地位，其中所有花枝是否同面、花枝长度的特征值（绝对值）较大，起决定作用，叶长具有最小的特征向量值（0.015）;第2主成分的方差贡献率为12.558%，其中中萼宽度、侧萼长度的特征向量值较大，株幅具有最小的特征向量值（0.004）;第3主成分的方差贡献率为8.891%，蕊柱长度、宽度的特征值最大，株高的特征值为0;第4主成分的方差贡献率为6.679%，主要反映花瓣厚度、蕊柱宽;第5主成分的方差贡献率为5.928%，特征值最大的是侧枝长度、唇瓣长度;第6主成分的方差贡献率为4.726%，主要反映侧萼宽度、叶片数;第7主成分的方差贡献率为4.518%，主要反映侧枝数、脱苞数。综上所述，前7个主成分筛选出了7个代表性的指标：所有花枝是否同面、花瓣厚度、侧枝长度、中萼宽度、蕊柱长度、叶片数、侧枝数，这些性状是造成火焰兰受测群体表型性状出现差异的主要影响因素，可作为后续火焰兰群体评价和亲本选育的重要形态指标。

 聚类分析

利用RStudio软件（ward方法）将204株火焰兰群体进行聚类分析（图1），结果表明，204株材料被分为5大类群，并计算出各个类群中各个性状的平均值（表4）。结果显示，第Ⅰ类群包括78株，主要特征是株型高、叶片数多于其他类群;第Ⅱ类群包含11株，主要特征是株幅大、分叉数、花朵数、侧枝数均多于其他类群;第Ⅲ类群包含31株，主要特征为花梗直径、第一分枝至基部的长度、侧萼长度、叶长叶宽均小于其他类群;第Ⅳ类群包含70株，主要特征是花瓣厚度、唇瓣长度、蕊柱长度、宽度均小于其他类群;第Ⅴ类群包含14株，主要特征为花梗直径、中萼宽度、侧萼长度、花瓣长度、花瓣宽度、唇瓣宽度、蕊柱长度、蕊柱直径、叶长度、叶宽度均大于其他类群。

 遗传多样性分析

从设计的20条引物中共筛选出2条扩增带最清晰、多态性最高、重复性最好的ISSR引物（UBC836与UBC807），对24份群体样本火焰兰个体进行PCR扩增（图2）。从2条引物的扩增结果可看出，扩增总条带为17条，其中多态性条带为17条，多态性比率为100%，平均每条引物扩增产生8.5条扩增产物。其中UBC836扩增位点数较多为9个，UBC807相对较少，扩增位点8个。结果表明，供试的24株火焰兰个体反映出群体的遗传变异较丰富，用ISSR分子标记方法检测该火焰兰群体的遗传多样性是可行的。

  基于标记的聚类分析

利用NTSYSpc 2.10e软件，基于ISSR分子标记对该批受测群体进行聚类分析，由图3可见，24个植株间的遗传距离在0.53～1.00之间，表明供试群体具有丰富的遗传多样性，在遗传相似性系数为0.70处，将该群体划分为5个类群。第Ⅰ类群包括6株，可进一步分为3个亚类，与其他类群之间的遗传距离最远，主要表现为花枝长度、花梗直径、株高、叶长均小于其他类群，花朵数也少;第Ⅱ类群和第Ⅴ类群均只包括1株，第Ⅱ类群的单株主要表现为分叉数多，中萼较长;第Ⅴ类群单株主要表现为花梗直径、株幅、中萼宽度、侧萼长度、宽度、唇瓣宽度、叶宽均大于其他类群的植株，第Ⅱ类群和第Ⅴ类群单株更像是变异单株;第Ⅲ类群的资源数量最多，包括13株，彼此之间遗传距离较远，主要表现为侧枝长度较长、叶片数较多;第Ⅳ类群包括3株，各性状均处于中间水平。

  讨论

多样性指数是评价种质资源多样性的一项重要指标，广泛应用于表型多样性评价，变异系数可描述性状的离散程度，大于 10%则表明差异较大。随着技术的发展，分子标记技术已经被广泛应用于遗传多样性的鉴定，但仍需要与表型性状结合，为分子研究提供可靠的数据。

本研究结果显示，火焰兰受测群体的植株形态与花部数量性状特征均有较大的差异。通过对外观株型的形态特征进行比较，结果显示，所有花枝是否同面变异系数最大（20.44%），叶长变异系数最小（8.71%），平均变异系数为11.22%，多样性指数范围为0.80～2.07;花部数量性状的形态特征中侧萼长的变异系数最小（6.25%），脱苞数的变异系数最大（181.02%），遗传多样性指数最大的为侧枝长度（2.07），遗传多样性指数最小的性状为侧枝数（0.62），这与姚靖的结果一致：火焰兰与花相关的性状是火焰兰主要的观赏性状。相关性分析结果表明，各个性状之间的相关关系比较复杂，且各个性状之间基本都存在相关性，这与陈和明等、张叶等、姚靖的研究结果类似。对26个表型性状进行主成分分析，结果显示前7个主成分包含了绝大部分的信息，累计贡献率达67.887%，根据贡献率大小选出的主要性状有所有花枝是否同面、花瓣厚度、侧枝长度、中萼宽度、蕊柱长度、叶片数、侧枝数，这7个代表性的指标是火焰兰受测群体表型出现差异的主要原因，且这些表型性状可作为今后火焰兰变异筛选的主要形态指标，这与姚靖的结果类似。以上结果均表明，204份火焰兰样本中存在丰富的多样性，可为火焰兰品种的选育提供丰富的亲本材料。

目前，分子标记已经成为遗传多样性分析和亲缘关系分析的主要途径。本研究利用具有多态性的ISSR引物对该群体进行聚类分析，进一步运用NTSYSpc 2.10e软件将该批受测群体分为5大类群。2种聚类分析结果均初步明确了各个类群的特征，结果基本一致。其中第Ⅱ类群可用于培育分叉数较多的性状;第Ⅳ类群各项性状表现均较差，可以剔除;第Ⅴ类群可用于选育花梗直径、中萼宽、侧萼长、唇瓣宽、叶宽等性状均表现优异的植株。多态性的聚类分析结果与基于表型特征的分类结果基本吻合，说明分子标记可用于火焰兰群体的遗传多样性分析，与姚靖的结论相同。同时，通过对表型性状的主成分分析、相关性分析、聚类分析及ISSR分子标记分析均验证了该组织培养衍生群体中存在性状多样性，当然其原因也不能排除组织培养过程中产生的体细胞变异和受环境影响产生表型变异等现象，具体原因还需进一步研究。

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