李和平 张树河 李瑞美 潘世明

摘  要：在高等植物中，蔗糖轉化酶广泛参与调节植物的生长发育、生物和非生物胁迫应答等过程，在控制光合产物在不同库组织的分配上起重要作用，是决定作物经济产量的关键酶。本研究以黑皮果蔗‘Badila’为实验材料，克隆了一个果蔗蔗茎中碱性转化酶基因，并对其序列特征、表达特性及其编码蛋白的酶学特征进行了分析。生物信息学分析发现基因cDNA全长共2859 bp，其中编码区为1254 bp，共编码417个氨基酸，其中精氨酸（Arg）含量最高，为12.7%，分子质量为46.29 kD，理论等电点为10.89，进化关系分析发现ShINV6蛋白与甘蔗、玉米、高粱等单子叶作物的中碱性蔗糖转化酶高度同源，具有典型的Glyco_hydro_100结构域，多重序列比对发现ShINV6蛋白的C端比其他转化酶少约130个氨基酸，细胞定位和亲水性分析预测ShINV6蛋白可能为细胞质中的亲水性蛋白。在果蔗生长发育过程中，观测蔗茎中的蔗糖含量变化，发现随着种植时间的延长蔗糖含量逐渐增加，其中10月至11月是糖分积累最多的月份。荧光定量PCR结果显示9月份表达量达到最大值，结合果蔗生长期生物产量增长规律推测ShINV很可能参与了蔗茎生长旺盛期光合作用产物蔗糖在蔗茎（库）中的卸载过程，把蔗糖转化成己糖以供蔗茎快速生长。

关键词：Badila;中碱性转化酶;;基因克隆中图分类号：S566.1      文献标识码：A

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Neutral / Alkaline Invertase Gene （） from ‘Badila’

LI Heping， ZHANG Shuhe， LI Ruimei， PAN Shiming

Institute of Subtropical Agriculture， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Zhangzhou， Fujian 363005， China

In higher plants， invertase is widely involved in regulating plant growth， development， biological and abiotic stress response， and plays an important role in controlling the distribution of photosynthates in different bank tissues. It is a key enzyme that determines crop economic yield. In this study， the neutral/alkaline invertase was cloned from the stem of ‘Badila’. The sequence characteristics， expression characteristics and enzymatic characteristics of its encoding protein were analyzed. Bioinformatics analysis found that the full length of cDNA was 2859 bp， including 1254 bp of ORF that encoding 417 amino acids， and the content of arginine （Arg） was 12.7%. The molecular weight of ShINV6 was 46.29 kD and the PI value was 10.89. Evolutionary relationship analysis showed that ShINV6 protein was highly homologous with the neutral / alkaline invertase of monocotyledon crops such as sugarcane， maize and sorghum. It has typical Glyco_hydro_100 domain， multiple sequence alignments revealed that the C-terminal of ShINV6 was about 130 amino acids less than other invertases. Cell localization and hydrophilic analysis predict that ShINV6 may be hydrophilic protein in cytoplasm. During the growth and development of sugarcane， the change of sucrose content in sugarcane stems was observed. It was found that the sucrose content increased gradually with the extension of planting time， and the most sugar accumulation month was from October to November. QRT-PCR results showed that expression reached its maximum in September， and combined with regulation of biological yield growth in sugarcane growing period， it was speculated that ShINV6 might be involved in the unloading process of sucrose which the product of photosynthesis in the peak growth stage of sugarcane stems （library）， and sucrose was transformed into hexaccharide for the rapid growth of sugarcane stems.

Badila; neutral/alkaline invertase; ;ene cloning

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.006

在多数植物中，植物叶片（源组织）通过光合作用将CO固定成碳水化合物，然后运向非光合组织（库组织），在此过程中主要以蔗糖的形式完成碳水同化产物由源到库的运输，在库组织中，蔗糖只有降解为单糖后才能进一步用于植物的生长发育。在植物中，蔗糖降解至少受两类不同酶的催化，一类为蔗糖合成酶（SUS），其在尿苷二磷酸（UDP）存在下，可催化蔗糖裂解为尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖，这一反应是可逆的;另一类为转化酶（invertase， Inv），催化蔗糖不可逆地降解为葡萄糖和果糖，是蔗糖代谢的关键酶。在高等植物中，转化酶是一个中等规模的基因家族，包含十几个到二十几个基因，其广泛参与调节植物的生长发育、生物和非生物胁迫应答等过程，在控制光合产物在不同库组织的分配上起重要作用，是决定作物经济产量的关键酶。

长期以来，蔗糖降解研究主要集中在酸性转化酶（Ac-Inv）和蔗糖合酶上，而对中碱性转化酶（A/N-Inv）的研究较少，认为它们仅是在Ac-Inv和SUS活性低时维持蔗糖基础代谢的酶。BARRATT等通过对拟南芥多个Sus基因和2个A/N-Inv基因的多重突变体植株的表型分析，发现A/N-Inv可能是控制碳源的不同库组织分配信号通路中的重要靶标，是植物正常生长所必需的基因，而SUS却并非必需。Ac-Inv广泛存在于动物、植物和微生物中，而N/A-Inv仅在可进行光合作用的生物，如植物和蓝细菌中。在甘蔗中，WANG等以比较基因组学为基础克隆了6个中碱性转化酶（ShN/AINVs）和8个酸性转化酶（ShAINVs），在不同的非生物胁迫下，INVs均受到显著抑制，且中碱性INVs受到抑制比酸性INVs更为突出;牛俊奇等也从甘蔗中克隆出，并发现苗期根和叶片中基因都受PEG和NaCl诱导表达，ZHENG等（未发表）在NCBI数据库登录了3个中碱性蔗糖转化酶基因，分别命名为、、，但其相关研究结果还未见发表。在黑皮果蔗中，中碱性蔗糖转化酶的研究还未见报道，本研究通过黑皮果蔗蔗茎转录组测序，获得了5个N/A-Inv基因，对其中一个新发现的中碱性转化酶进行验证和细致分析，以期为果蔗蔗茎糖分累积规律研究奠定基础。

  材料与方法

材料

供试材料为黑皮果蔗‘Badila’，2019年3月中旬种植于福建省农业科学院亚热带农业研究所试验基地，在果蔗生长3个阶段的蔗茎中段进行采样，分别为7月初（生长初期）、9月初（拔节期）、11月中旬（成熟期），设置3个重复，蔗茎在实验室劈成小片后液氮速冻，–80℃保存备用。

  方法

1.2.1  糖分测定  使用WYF1（0-51）型糖量计对黑皮果蔗进行田间锤度（Bx）测定，7—12月每月上旬固定测一次，每次测定生长良好且整齐的植株10株，记录测定值，使用公式：蔗糖分=×1.0825–7.703，计算蔗糖分。

1.2.2  总RNA提取与cDNA合成  果蔗蔗茎总RNA提取采用成都福际生物技术有限公司的植物总RNA提取试剂盒，RNA浓度用超微量核酸蛋白测定仪检测。采用Aidlab公司反转录试剂盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）进行反转录操作，合成cDNA，–20℃保存备用。

1.2.3  果蔗基因克隆与生物信息学分析  黑皮果蔗转录组由北京百迈客生物科技有限公司基于Illumina高通量测序平台获得，搜索注释结果查找N/A-Inv基因，发现有5个N/A-Inv基因，通过网上比对后对其中一个新基因进行克隆与序列验证，并将此基因命名为。将序列导入GENETYX软件中，预测其ORF序列及氨基酸序列。用ProtParam工具预测分子质量、分子式、理论等电点、不稳定指数等理化性质指标。利用ProtScale工具分析ShINV6蛋白的亲/疏水性。通过Softberry网站中ProtComp程序预测ShINV6蛋白的定位。GOR4在线工具用于预测蛋白质二级结构，SWISS-MODEL在线工具用于预测蛋白三级结构。

1.2.4  qRT-PCR反应  根据验证过的基因序列，设计荧光定量引物（表1），基因作为内参。使用Analytikjena-qTOWER2.2型荧光定量PCR仪和成都丹凤科技有限公司生产荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR，程序及体系：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，58℃退火延伸30 s，共40个循环，溶解曲线分析（60～95℃，+1℃/循环，保持时间4 s）。每个样品设置3个重复，取平均值，各个样品中目的基因相对表达量的计算通过仪器软件qPCRsoft 3.2自动执行，以为内参，利用2计算各個样品的基因相对表达量。

 结果与分析

2.1  全长的获得

通过转录组数据库获得的cDNA序列全长，然后经过引物设计、基因扩增和测序验证序列准确性，得到2859 bp的cDNA序列（图1），GENETYX软件预测基因编码区为1254 bp，共编码417个氨基酸（图2），其中精氨酸（Arg）含量最高，为12.7%。其次是亮氨酸（Leu），含量为10.3%。ProtParam工具预测分子质量为46.29 kDa，分子式为CHNOS，理论等电点为10.89，其中带有负电残基（Asp+Glu）42个，带有正电残基（Arg+Lys）67个，不稳定指数为47.02，表明该蛋白不稳定。

蛋白生物信息学分析

用NCBI网上BLASTP程序对ShINV6蛋白进行功能域分析，结果（图3A）显示ShINV6蛋白在17至161氨基酸位点间有Glyco_hydro_100结构域，此结构域是细菌和植物中碱性蔗糖转化酶的保守结构域。利用ProtScale工具分析ShINV6蛋白的亲/疏水性，结果（图3B）显示：27位丙氨酸（Ala）分值最大，为2.067，疏水性最强;297位谷氨酰胺（Gln）分值最小，为–3.522，亲水性最强;从整个序列来看，亲水性氨基酸明显多于疏水性氨基酸且序列整体分值为负，预测该蛋白是亲水性蛋白。通过Softberry网站中ProtComp程序预测ShINV6蛋白的定位，发现最高分是细胞质蛋白，得分7.1分，表明ShINV6蛋白较大可能是细胞质中的中碱性蔗糖转化酶。ShINV6蛋白的二级结构预测结果发现，α-螺旋含量为35.49%，延伸链为15.59%，无规则卷曲结构含量达到48.92%（图3C）。三级结构预测总共搜出來21个模板，建出1个Model，结果（图3D）显示，ShINV6蛋白晶体结构与鱼腥藻中碱性蔗糖转化酶接近，α-螺旋和无规则卷曲结构较多。

 多序列比对和系统进化

在NCBI网站上用BLAST功能对ShINV6蛋白进行同源蛋白搜索，并利用blast tree view工具，用邻接法构建系统进化树，结果（图4）发现参加进化树构建的蔗糖转化酶蛋白可分为两大类，ShINV6蛋白与甘蔗、玉米、高粱等单子叶作物的中碱性蔗糖转化酶高度同源，下载这些同源性较高的序列（甘蔗2个：ShA/NINV4，ShA/NINV5;玉米1个：ZmINV;高粱1个：SbINV1），利用DNAMAN软件进行多重序列比对，发现ShINV6与其他4个蛋白的中间有145个氨基酸相似性较高，而两端与其他蛋白没有相似性，且C端比其他少约130个氨基酸（图5）。

在蔗茎发育过程中表达特性

在果蔗生长发育过程中，蔗茎中的蔗糖含量随着种植时间的延长而逐渐增加（图6A），3月种植的黑皮果蔗，在7月拔节初期时蔗糖分含量为1.43%，而到成熟期（12月）蔗糖分含量可达10.26%，糖分累积明显，其中10—11月是糖分积累最多的月份。对7、9、11月3个时间点的基因进行qRT-PCR分析，结果显示（图6B），在9月表达量达到最大值，约是生长初期（7月）表达量的20倍，约是成熟期（12月）表达量的57倍。

讨论

目前，关于甘蔗中碱性转化酶的研究主要集中在基因克隆和诱导表达方面，对于生长发育中蔗茎的中碱性转化酶研究鲜有报道。本研究克隆了一个果蔗蔗茎中碱性转化酶基因，对其序列特征、表达特性及其编码蛋白的酶学特征进行了分析。多重序列比对发现ShINV6蛋白两端与其他蛋白没有相似性，且C端比其他少约130个氨基酸。WANG等克隆了14个甘蔗蔗糖转化酶基因，发现各基因编码的蛋白质氨基酸残基数存在较大差异，最少的是211个氨基酸残基，最多的是629个氨基酸残基。SHEN等克隆了7个辣椒中碱性蔗糖转化酶基因，同样发现各基因编码的蛋白质氨基酸残基数存在较大差异，最少的是286个氨基酸残基，最多的是655个氨基酸残基。ShINV6蛋白理化性质指标预测发现，在17至161氨基酸位点间具有典型的中碱性蔗糖转化酶特有的Glyco_hydro_100结构域，分子质量为46.29 kD，理论等电点为10.89，较大可能是细胞质中的中碱性蔗糖转化酶。

转化酶参与了蔗糖的裂解，从而改变园艺果实的糖组成和风味品质，参与了植物发育的许多过程，并响应生物胁迫。在拟南芥中，一个胞液A/N-Inv基因的点突变体转化酶活性均明显降低，造成主根变短、叶片和角果变小、花期提前。在豆科模式植物白脉根中，一个A/N-Inv基因LjINV1的功能缺失突变严重影响植株生长和花器官发育，植株明显矮化并不能产生花粉，同时根部和叶片正常细胞的分裂和生长也受抑制。本研究中，9月表达量达到最大值，根据以往的观测数据，7—9月是蔗茎生长最旺盛的月份，表明很可能参与了蔗茎生长旺盛期光合作用产物蔗糖在蔗茎（库）中的卸载过程，把蔗糖转化成己糖以供蔗茎快速生长。在库尔勒香梨转化酶与果实发育、成熟和糖的积累研究中，发现碱性转化酶活性在果实发育过程中，其活性出现明显的先升后降的趋势，结果与本研究相似。基因功能分析为研究果蔗蔗茎生长发育过程中碳代谢提供了有价值的参考信息。

  结论

本研究克隆了果蔗蔗茎中碱性转化酶的一个成员，生物信息学分析发现基因共编码417个氨基酸，分子质量为46.29 kD，理论等电点为10.89，进化关系分析发现ShINV6蛋白与甘蔗、玉米、高粱等单子叶作物的中碱性蔗糖转化酶高度同源并聚为一类，细胞定位和亲疏水性分析预测ShINV6蛋白可能为细胞质中的亲水性蛋白。荧光定量PCR结果显示9月份表达量达到最大值，推测很可能参与了蔗茎生长旺盛期光合作用产物蔗糖在蔗茎（库）中的卸载过程，把蔗糖转化成己糖以供蔗茎快速生长。

参考文献

1. BARRATT D H P， DERBYSHIRE P， FINDLAY K， PIKE M， WELLNER N， LUNN J， FEIL R， SIMPSON C， MAULE A J， SMITH A M. Normal growth of requires cytosolic invertase but not sucrose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2009， 106（31）： 13124-13129.
2. PAN L Z， GUO Q W， CHAI S L， CHENG Y， RUAN M Y， YE Q J， WANG R Q， YAO Z P， ZHOU G Z， LI Z M， DENG M H， JIN F M， LIU LC AND WAN H J. Evolutionary conservation and expression patterns of neutral/alkaline invertases in [J]. Biomolecules， 2019， 9（12）：763.
3. ZHANG S L， ZHANG Z， SUN X， LIU Z Q， MA M， FAN J B， LUO W Q， WANG L B， ZHANG S L. Identification and characterization of invertase family genes reveal their roles in vacuolar sucrose metabolism during Rehd fruit development[J]. Genomics， 2021， 113（3）： 1087- 1097.
4. SIEMENS J， GONZALEZ MC， WOLF S， HOFMANN C， GREINER S， YEJIE DU， RAUSCH T， ROITSCH T， LUDWIG-MÜLLER J. Extracellular invertase is involved in the regulation of clubroot disease in [J]. Molecular Plant Pathology， 2011， 12（3）： 247-62.
5. PROELS R K， ROITSCH T. Extracellular invertase of tomato： a pivotal enzyme for integration of metabolic， hormonal， and stress signals is regulated by a diurnal rhythm[J]. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（6）： 1555-1567.
6. LIU S J， LAN J X， ZHOU B H， QIN Y X， ZHOU Y H， XIAO X H， YANG J H， GOU J Q， Q I J Y， HUANG Y C， TANG C R. HbNIN2， a cytosolic alkaline/neutral-invertase， is responsible for sucrose catabolism in rubber-producing laticifers of （para rubber tree）[J]. New Phytologist. 2015， 206（2）： 709-725.
7. 牛俊奇， 王愛勤， 黄静丽， 杨丽涛， 李杨瑞. 甘蔗中性/碱性转化酶基因的克隆和表达分析[J]. 作物学报， 2014， 40（2）： 253-263.NIU J Q， WANG A Q， HUANG J L， YANG L T， LI Y R. Cloning and expression analysis of sugarcane alkaline/neutral invertase gene [J]. Acta Agronomica Sinica， 2014， 40（2）： 253-263. （in Chinese）
8. QI X P， WU Z C， LI J H， MO X R， WU S H， CHU J， WU P. AtCYT-INV1， a neutral invertase， is involved in osmotic stress-induced inhibition on lateral root growth in [J]. Plant Molecular Biology， 2007， 64： 575-587.
9. WELHAM T， PIKE J， HORST I， FLEMETAKIS E， KATINAKIS P， KANEKO T， SATO S， TABATA S， PERRY J， PARNISKE M AND WANG T L. A cytosolic invertase is required for normal growth and cell development in the model legume， [J]. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（12）： 3353-3365.