徐石勇　李欧静　张舒玮　邓慧　刘征辉　王永　兰青阔

摘 要：以金银花及其常见变种为材料，利用SSR标记技术构建分子指纹图谱，并用于遗传多样性分析。选择25个SSR位点用于多态性分析，其中3个位点具有较强多态性，并构建基于Excel格式的金银花SSR指纹图谱，包括3对引物在6个供试材料中扩增到的18条多态性条带信息。应用该指纹图谱对金银花及其变种的遗传多样性进行分析，结果表明，金银花与山银花之间遗传距离较远，仅0.28。应用该指纹图谱对87个市售金银花进行分析，能够区分出河北、山东、河南等地的金银花品种。SSR标记技术具有快速、稳定的优点，具备金银花种质资源标准化分析及中药材市场化检测应用的价值。

关键词：金银花；SSR标记；指纹图谱；遗传多样性

中图分类号：Q946 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.003

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、凉散风热的功效，为常用大宗中药材。现代医学研究表明金银花中含有木犀草黄素、肌醇、皂甙、绿原酸，糖类、蛋白质、维生素、多种化合物及多种微量元素，一些常用药如银翘解毒丸、清开灵、银黄片等均以金银花为主要原料。随着我国对金银花开发利用的突破性进展，其在茶饮、日化、化妆品和保健品等领域的需求急剧增大。为满足市场需求，我国近年来大面积种植金银花药材，但在种质资源鉴定及遗传多样性分析方面还没有一套标准化的方法。

简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR），也称微卫星DNA，是一类由几个（一般为1～5个）核苷酸为重复单位组成的核苷酸串联重复序列。SSR标记具有多态性丰富、重复性好、共显性、分布广等优点，常用于蔬菜遗传育种[1]、基因定位[2]、遗传图谱构建[3]、种质鉴定等。玉米[4]、小麦[5]、棉花[6]等主要农作物已建立成熟的基于SSR标记的种子鉴定技术标准及配套的指纹图谱。本研究以金银花及其常见变种为材料，应用SSR分子标记技术建立指纹图谱，并对河北、山东、河南金银花样品的遗传多样性进行分析，为促进金银花药材鉴定标准化与品种选育提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、金银花、金银花4倍体等标准品（依次编号为S1～S6，表1），以及购自山东、河南的87个市售金银花样品，由天津海世达检测技术有限公司提供，研磨后用于DNA提取。

1.2 基因组DNA提取

参照Murray&Thompson[7]方法，做适当改良后用于金银花基因组DNA提取。DNA浓度用NanoDrop-1000 spectrophotometer（Thermo）检测并稀释至50 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。

1.3 SSR位点信息与引物

从GenBank数据库查询金银花核酸序列369条，使用BatchPrimer3在线软件扫描分[8]获得32个候选SSR位点，并设计SSR-PCR引物。并结合文献查阅，确定25对引物（表2）用于多态性分析。

1.4 SSR-PCR分析

PCR反应采用10 μL体系：其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，DNA模板0.5 μL（50 ng·μL-1），灭菌去离子水补足至10 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min；35个循环反应（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72℃ 30 s）；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR仪为ABI veriti 96 well Thermol cycler。聚丙烯酰胺凝电泳：胶浓度为8%，电压250 V，电泳1 h；采用银染法进行显色。

1.5 数据分析

凝胶显色后置于凝胶成像系统拍照，使用GeneTools（Sygene）软件对电泳图谱中稳定且易分辨的条带进行分子量分析；聚类分析使用SLT-NTSYS（2.10）软件。

2 结果与分析

2.1 金银花SSR位点多态性检测

以6份材料DNA为模板，对25对SSR引物进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳。筛选结果发现，25对引物中4对无扩增条带，有13对引物扩增出的条带大于1条，说明该13个SSR位点在6个材料中具有多态性。其中位点jp.ssr48、jp.ssr58和jp.ssr59多态性较高（图1），适合于金银花SSR分子指纹图谱的构建。

2.2 金银花SSR指纹图谱构建

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，比较3个SSR位点在6份材料中的多态性。将每个样品的特异性谱带按照相互位置差异在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建基于Excel格式的SSR指纹图谱[9]。SSR指纹图谱包含了6个材料3个SSR位点信息，共18个条带，平均每对引物 6条（表3）。

2.3 金银花SSR标记遗传多样性分析与应用

对6个样品进行遗传多样性分析，结果表明6个材料分为2大类（图2），大毛花及其4倍体为一类，灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬为另一类，山银花与金银花遗传距离较远，仅0.28。山银花中灰毡毛忍冬、华南忍冬遗传距离最近，其次为红腺忍冬，再次为黄褐毛忍冬。

使用上述3对SSR引物，对购自河北省巨鹿县、山东省平邑县、河南省封丘县的87个金银花样品进行PCR-SSR检测及聚类分析。结果表明，三产地的样品与山银花的遗传距离较远，全部为金银花样品；但又可分为两类，其中一类为来自河北省巨鹿县的50个样品和来自河南省封丘县的6个样品，其一致性很强，表明两地金银花品种的亲缘关系很近；来自山东省平邑县的8个样品被归于另一类，但又细分为5小类。

3 结论与讨论

来源纯正、品质优良的药用植物资源是中药现代化和标准化生产的重要前提。金银花是我国常用大宗中药材，亟需对其开展遗传多样性分析并建立标准化的种质资源鉴定方法。自2007年以来，我国科学家应用RAPD[10]、RFLP[11-12]、同工酶[13]、ISSR[14-15]、DNA Barcoding[16]等标记技术对金银花及其变种进行遗传多样性分析，取得了显著的效果。但上述标记技术也存在着重现性差、样品用量大、周期长、操作复杂等缺陷，未能实现标准化。SSR标记具有鉴别力高、开发成本低、操作相对自动化、不受环境影响等优点，被普遍认为是最接近于理想化的品种鉴定技术[17-20]。随着测序技术和生物信息学技术的发展，通过网络可以免费获得海量的EST等序列信息及具有SSR扫描及引物设计功能的生物软件，这为EST-SSR标记的开发提供经济、便利的条件。

蒋超等[21]对忍冬及其变种红白忍冬的EST序列进行生物信息学分析，初步了解其SSR多态性特点，并通过试验证明了SSR标记可用于忍冬及其变种、山银花原植物的鉴别。本研究通过对2种金银花及其4种山银花伪品进行SSR标记位点探索开发，构建小规模的指纹图谱，并初步应用于金银花种植资源遗传多样性分析及种质鉴定分析。结果表明，SSR标记技术具有快速、稳定的优点，具备金银花种质资源标准化分析及中药材市场化检测应用的价值。但本研究存在样本基数小、筛选位点少等问题，需要进一步从全国范围内扩大种质资源的搜集，开展大规模的EST-SSR位点筛选。

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