陈坚 肖宗位 高珂 李源 刘先 王晓玮 李阳 毛龙

食管癌是临床上常见的消化系统肿瘤，全球确诊患者80%来自发展中国家，而且男性患者的发病率是女性的3倍[1]。虽然食管癌患者在治疗上有所改善，但是5年的总生存率和5年手术切除食管的患者生存率(15%～40%)依然很差[2]。2015年中国患有食管癌高达24.5万例，其发病率和死亡率已经高于全球的平均水平[3,4]。长链非编码RNA在多种肿瘤疾病的发生发展中已经取得了明显的作用效果，可以调节下游miRNA的表达发挥肿瘤促进或抑制的作用，为食管癌的治疗和预后提供新的证据[5]。Wu等[6]研究显示，XIST在食管鳞状癌组织和食管癌细胞中表达上调，与不良预后显著相关；XIST通过miR-101/EZH2调节食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-511-3p前列腺癌组织和癌细胞中表达下调，与癌症分期和较短的总生存率显著有关，miR-511-3p通过下调AKT3抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[7]，但是在食管癌细胞中研究机制尚不明确。本研究探讨XIST通过靶向miR-511-3p表达对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，旨在为食管癌的临床研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 正常食管黏膜上皮细胞Het-1A和食管癌细胞EC9706、Eca109、TE-1、KYSE150均购自中国科学院上海细胞库；Lipofectin 2000试剂盒、TRIzol试剂盒均购自美国Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司；si-NC、si-XIST、miR-NC、miR-511-3p、anti-miR-NC和anti-miR-511-3p均购自上海吉玛公司；Prime Scrip试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒均购自大连Ta Ka Ra公司；引物购自上海生工公司；MTT试剂盒购自碧云天公司；Transwell小室、Matrigel基质胶均购自美国Corning公司；PCNA抗体、MMP-抗体2和GAPDH抗体均购自美国abcam公司；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养与转染 将冷冻的正常食管黏膜上皮细胞Het-1A和食管癌细胞EC9706、Eca109、TE-1、KYSE150复苏后，在5% CO2饱和湿度、温度为37℃的恒温培养箱内进孵育，细胞均在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基内进行培养。细胞密度生长至85%，加入胰蛋白酶消化培养。取对数生长期的食管癌细胞Eca109，接种至6孔板内，将细胞分组，分别为：si-NC组(转染si-NC)、si-XIST组(转染si-NC)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-511-3p组(转染miR-511-3p)、si-XIST+anti-miR-NC组(共转染si-XIST和anti-miR-NC)和si-XIST+anti-miR-511-3p组(共转染si-XIST和anti-miR-511-3p)。食管癌细胞Eca109转染时严格参照Lipofectin 2000试剂盒说明书。

1.3 qRT-PCR检测XIST和miR-511-3p的表达 采用TRIzol试剂盒说明书提取食管癌细胞Eca109中的总RNA，然后将总RNA进行反转录合成cDNA模板，步骤参照Prime Scrip试剂盒说明书。最后采取SYBR Premix Ex Taq试剂盒的说明书配置反应体系进行PCR扩增，分别以β-actin和U6作为内参，按照公式2-ΔΔCt计算XIST和miR-511-3p的表达量。

1.4 MTT检测细胞的增殖 收集对数生长期的食管癌细胞Eca109接种至96孔板内，密度为1×103个/孔铺在孔板内。置入恒温培养箱内继续培养24 h、48 h、72 h时，每孔按照20 μl加入MTT溶液，遮光继续反应4 h后，加入100 μl DMSO试剂，在摇床上震荡快速混匀后，酶标仪490 nm处检测96孔板内的光度值。

1.5 Transwell法检测细胞的迁移和侵袭 细胞迁移实验：收集对数生长期的食管癌细胞Eca109，消化后接种至24孔板内(密度为2×105个/ml)，取出200 μl添加在Transwell小室上室内，下室添加600 μl的含有胎牛血清的RPMI 1640培养基培养液，随后置于恒温培养箱内继续培养24 h。倒去培养基，采用多聚甲醇固定15 min，再采用结晶紫染色15 min，擦去小室内层的细胞，冲洗，在显微镜下观察细胞迁移数目。细胞侵袭实验：将Matrigel基质胶解冻后，按照5∶1(不含血清培养RPMI 1640培养基：Matrigel基质胶)稀释，取出50 μl铺于Transwell小室上室内，培养6 h，其余步骤同上述细胞迁移实验一致。

1.6 Western blot检测PCNA和MMP-2的蛋白表达 收集对数生长期的食管癌细胞Eca109加入蛋白裂解液，混匀后，提取总蛋白，采用BCA试剂盒定量检测蛋白浓度，取35 μg上样蛋白在凝胶电泳处理，将处理后的蛋白转移至PVDF膜。PVDF膜内采用5%脱脂奶粉封闭培养2 h，加入一抗蛋白4℃过夜孵育，PBST清洗后，加入二抗室温下孵育，PBST清洗后加入电化学发光液，显影。采用ImageLab 6.0.0软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的表达。

1.7 双荧光素酶报告实验验证XIST和miR-511-3p的关系 通过在线软件Starbase预测XIST和miR-511-3p互补的核苷酸序列，构建双荧光素酶报告载体XIST-wt和XIST-mut，参照Lipofectin 2000试剂盒的说明书与miR-NC或miR-511-3p转染至食管癌细胞Eca109内，继续培养48 h，通过双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 XIST和miR-511-3p在食管癌细胞中表达 与正常食管黏膜上皮细胞Het-1A相比，食管癌细胞EC9706、Eca109、TE-1、KYSE150中XIST表达均显著增加(P<0.05)，miR-511-3p表达均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 XIST和miR-511-3p在食管癌细胞中表达

2.2 干扰XIST对食管癌细胞Eca109增殖、迁移和侵袭的影响 与si-NC组比较，si-XIST组的XIST表达、OD值(48 h、72 h)、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、PCNA和MMP-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表2，图1。

表2 干扰XIST对食管癌细胞Eca109增殖、迁移和侵袭的影响

2.3 过表达miR-511-3p对食管癌细胞Eca109增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-511-3p组的miR-511-3p表达显著增加，OD值(48 h、72 h)、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、PCNA和MMP-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2，表3。

表3 过表达miR-511-3p对食管癌细胞Eca109增殖、迁移和侵袭的影响

2.4 XIST靶向miR-511-3pp表达 XIST和miR-511-3p存在互补的核苷酸序列，与miR-NC组比较，miR-511-3p组XIST-wt荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与si-NC组比较，si-XIST组XIST表达显著降低(P<0.05)，miR-511-3p表达显著增加(P<0.05)。见图3，表4、5。

图3 XIST和miR-511-3p存在互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

表5 XIST靶向miR-511-3p的表达

2.5 抑制miR-511-3p可以逆转干扰XIST对食管癌细胞Eca109增殖、迁移和侵袭的影响 与si-XIST+anti-miR-NC组比较，si-XIST+anti-miR-511-3p组的miR-511-3p表达显著降低，OD值(48 h、72 h)、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、PCNA和MMP-2蛋白表达显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6，图4。

表6 抑制miR-511-3p可以逆转干扰XIST对食管癌细胞Eca109增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨论

长链非编码RNA-X染色体失活特异转录物(lncRNA XIST)在多种肿瘤(结直肠癌、胃癌、胰腺癌和食管癌等)中表达上调，与肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移显著相关[8,9]。XIST可以介导内源竞争RNA调控网络参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为[10]。Liu等[11]研究，显示XIST与miR-34a存在互补核苷酸序列，XIST通过负调控miR-34a的表达抑制甲状腺癌的转移。Zheng等[12]研究结果显示，XIST通过调控miR-337/JAK2发挥在胃癌中作用。在胰腺癌的研究中结果显示，XIST在转移的胰腺癌组织中表达上调，XIST通过上调miR-429调节ZEB1表达促进胰腺癌的迁移、侵袭和EMT[13]。XIST还可以通过下调miR-212-3p/CBLL1轴抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭和EMT[14]。Chen等[15]研究显示，XIST在食管癌组织和细胞中高表达，抑制XIST显著抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，XIST通过激活JAK2/STAT3信号通路调控miR-494/CDK6发挥在食管癌中的致癌作用。本研究结果显示，在正常食管黏膜上皮细胞比较，XIST在食管癌细胞高表达，干扰XIST可以显著抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，与Chen等[15]研究结果一致，说明XIST可以作为食管癌的潜在生物标志物，发挥致癌的作用。

miRNA通过参与癌症细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学过程调节肿瘤的进展[16]。miR-652-5p、miR-7-2-3p、miR-3925-3p和miR-219-3p被报道显示与食管癌相关，其中miR-652-5p和miR-7-2-3p与总生存率显著相关[17]。Han等[18]研究显示，miR-485-5p在食管癌细胞中表达上调，抑制miR-485-5p可以明显抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这与本研究结果相反。Zang等[19]研究结果显示，过表达miR-124可以明显抑制食管癌细胞的增殖和迁移，miR-124通过负调节NRP1表达参与食管癌的发生。Yin等[20]研究显示，miR-133a-3p通过靶向负调控COL1A1抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其细胞凋亡。miR-511-3P在肺腺癌、结直肠癌和心血管疾病等有关[21-23]，但是miR-511-3p食管癌中尚无明确报道。本研究结果显示，与正常食管黏膜上皮细胞比较，miR-511-3p在食管癌细胞低表达，过表达miR-511-3p可以显著抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，双荧光素酶实验和qRT-PCR实验证明了XIST可以靶向负调控miR-511-3p表达，抑制miR-511-3p可以逆转干扰XIST对食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭的作用，这说明XIST通过下调miR-511-3p发挥在食管癌细胞中的作用。

综上所述，干扰XIST可以明显抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与上调miR-511-3p有关。