牛姝 张宁 王媛 张弛 张梦瑶 田硕 赵志刚

结直肠癌(CRC)是最常见的消化道肿瘤之一，严重威胁人类的健康，它的发病率已经占恶性肿瘤的第3位，病死率继肺、肝、胃、食管后第5位[1]。近年来随着生活水平的提高和人口老龄化，我国2型糖尿病患者呈上升趋势。2型糖尿病现在已成为世界性非传染性流行病，全世界现有确诊糖尿患者约2.2亿。多项研究显示，2型糖尿病不但可诱发和加重多种全身性疾病，如心脑血管系统疾病，更有增加恶性肿瘤发生的风险，2型糖尿病影响CRC的发生发展、治疗及预后[2]。但这一风险性增加的可能机制仍不十分明确。ERK1/2可以将多种细胞外信号，经过磷酸化活化逐级传递至细胞核，并激活多种核转录因子，参与细胞生长、发育、分裂及分化等[3,4]，是多种生长因子如表皮生长因子(EGF)[5]、神经生长因子(NGF)[6]、血小板源性生长因子(PDGF)[7]等的下游蛋白，在肿瘤侵袭和转移过程中ERK及其信号途径起中介和放大信号作用：接受来自丝裂原、生长因子、环境刺激等的信号；通过ERK信号级联反应作用于核转录因子如AP21、NF2kB等，调控基因表达[8,9]。因此探讨糖尿病合并CRC中p-ERK1/2 的表达与临床病理及患者生存的相关性具有重要的应用前景，以期为肿瘤新的观测指标及治疗靶点进一步理清思路，为结直肠癌的防治决策提供有益参考，从而进一步指导患者的临床治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年3月至2017年1月石家庄市人民医院病理科经病理明确诊断的结直肠癌手术切除组织标本59例，其中男37例，女22例；年龄≤50岁者4例，>50岁者55例。肿瘤最大直径<5 cm者19例，≥5 cm者40例；T1～2期7例，T3～4期 52例；高、中分化47例，低分化12例；无淋巴结转移者34例，有淋巴结转移者25例。病理分期参照2010年第7版美国癌症联合委员会TNM分期标准。其中伴有2型糖尿病CRC患者29例(CRC/DM组)，不伴2型糖尿病CRC患者30例(CRC组)。CRC/DM组与CRC组患者在性别比、年龄等方面有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合2010年WHO消化系统肿瘤分类关于结直肠腺癌的诊断标准，并经术后组织病理检查确诊为结直肠腺癌；②采取手术治疗；③所有患者术前均未接受放化疗、放疗以及其他抗肿瘤治疗。

1.2.2 排除标准：①合并其他肿瘤的患者；②合并1型糖尿病的患者。

1.3 病理资料 复习切片，选择用于免疫组化研究的肿瘤组织；复习所有切片，选择无明显退变坏死的存档石蜡包埋肿瘤组织。

1.4 免疫组化及结果评估 免疫组化染色方法：采用免疫组化SP法检测59例手术切除癌组织中P-ERK1/2的表达。鼠抗人P-ERK1/2磷酸化单克隆抗体和SP试剂盒、DAB显色剂均购于北京中杉金桥生物公司，所有流程按试剂盒说明书操作进行染色。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化法(Streptavidin-Peroxidase,SP),癌组织标本采用甲醛溶液固定24 h、脱水、常规石蜡包埋，制作成4 μm厚的石蜡组织切片，常规脱蜡至水化后，60℃烤箱烤片2 h。经常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯，水化后，进行S-P免疫组织化学染色，P-ERK1/2的一抗稀释度为1∶100，二抗的稀释度1∶200。采用PBS液代替一抗作为阴性对照，北京中杉金桥公司提供的阳性片作为阳性对照。结果判定标准：所有切片均由2位病理科资深医生双盲阅片，2位专家意见不一致时请第3位病理学医生阅片，最终确定结果。P-ERK1/2蛋白阳性表现为细胞浆和(或)细胞核内有棕黄色或黄色颗粒。P-ERK1/2阳性分级标准：先按阳性细胞所占百分比打分，阳性细胞百分率<5%为0分，5%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；再按细胞的着色强度打分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，参考Zhong等[10]的报道：阳性细胞百分比与细胞的着色强度乘积：评分≤3分为(-)，>3分为(+)。

1.5 随访 随访截止2020年1月，对所有手术患者进行随访术后36个月患者的生存情况，生存时间定义为术后到患者死亡的时间。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，2组间计数资料的比较采用χ2检验和Fisher确切概率法，关联分析采用Spearman相关分析方法，采用Kaplan-Meier进行生存率相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P-ERK1/2在CRC组和CRC/DM组癌组织中的表达情况 P-ERK1/2棕黄色或黄色颗粒主要在细胞浆和(或)细胞核内表达。30例CRC组的癌组织中有5例P-ERK1/2表达阳性，阳性表达率为16.6%；29例CRC/DM组的癌组织中有12例P-ERK1/2表达阳性，阳性表达率为41.4%，CRC/DM组P-ERK1/2蛋白表达的阳性率明显高于CRC组(χ2=4.390，P=0.036)。见图1。

CRC组CRC/DM组

2.2 P-ERK1/2表达与CRC组和CRC/DM组癌组织临床病理特征相关性

2.2.1 CRC组P-ERK1/2表达与临床病理特征关系：CRC组P-ERK1/2蛋白阳性表达5例，与患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤长径、T分期和淋巴结转移均无相关关系(P>0.05)。见表1。

表1 CRC组癌组织中P-ERK1/2的表达与患者临床病理特征的关系 例(%)

2.2.2 CRC/DM组P-ERK1/2表达与临床病理特征关系：CRC/DM组P-ERK1/2蛋白阳性表达有12例，与患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤长径、T分期和淋巴结转移均无相关关系(P>0.05)。见表2。

表2 CRC/DM组癌组织中P-ERK1/2的表达与患者临床病理特征的关系 例(%)

2.2.3 所有患者P-ERK1/2表达与临床病理特征关系：不考虑糖尿病，在所有59例患者中P-ERK1/2蛋白阳性表达有17例，P-ERK1/2蛋白阴性表达有42例。女性组10例P-ERK1/2表达阳性，阳性表达率为45.5%，男性组7例P-ERK1/2表达阳性，阳性表达率为18.9%，女性组P-ERK1/2阳性表达率明显高于男性组(χ2=4.736，P=0.03)。无淋巴结转移组14例P-ERK1/2表达阳性，阳性表达率为41.2%，有淋巴结转移组3例P-ERK1/2表达阳性，阳性表达率为12%，无淋巴结转移组P-ERK1/2阳性表达率明显高于有淋巴结转移组(χ2=5.979，P=0.014)；P-ERK1/2的表达与患者的年龄、分化程度、肿瘤长径、T分期均无相关关系(P>0.05)。见表3。

表3 所有癌组织中P-ERK1/2的表达与患者临床病理特征的关系 例(%)

2.3 CRC组和CRC/DM组患者术后生存时间和生存率比较 对所有手术患者随访手术后36个月患者的生存情况，Kaplan-Meier 生存分析及 Log-rank 检验结果显示，对59例患者随访，随访时间为1～36个月，中位随访时间为29个月。30例CRC组患者中有12例死亡，病死率为40%，29例CRC/DM组患者中有23例死亡，病死率为79.3%，CRC/DM组患者术后病死率明显大于CRC组(χ2=9.443，P=0.002)。CRC组的中位生存时间是26个月，CRC/DM组中位生存时间是19个月，CRC组患者手术后生存时间明显大于CRC/DM组(P=0.0304)。CRC/DM组患者较CRC组患者生存率低，病死率高，采用Kaplan-Meier进行生存分析，两条生存曲线明显分开(P<0.05)。见图2。

图2 CRC组和CRC/DM组患者手术后生存时间比较

2.4 所有患者P-ERK1/2蛋白阳性表达和阴性表达手术后患者生存率比较 不考虑糖尿病，在所有59例患者中P-ERK1/2蛋白阳性表达有17例，有10例死亡，病死率为58.8%；P-ERK1/2蛋白阴性表达有42例，有25例死亡，病死率为59.5%。P-ERK1/2蛋白阳性表达组的中位生存时间是22个月，而P-ERK1/2蛋白阴性表达组的中位生存时间是21个月，P-ERK1/2蛋白阳性表达组与阴性表达组死亡率无明显差异(P=0.988)。见图3。

图3 P-ERK1/2蛋白阳性表达组和阴性表达组手术后生存时间比较

3 讨论

伴随着社会的进步，肿瘤已经成为威胁人类健康的头号杀手。肿瘤的发生发展是多基因、多因素、多步骤综合调控、复杂作用的结果。细胞外信号调节激酶ERK1/2是一类属于丝/苏氨酸蛋白激酶，它是一种具有传导丝裂原信号的信号转导性蛋白。ERK1/2能够接受各自环境刺激、生长因子或者丝裂原等信号，并且通过ERK信号通路，可以把接受的信号进行级联反应，并作用于下游因子，最终达到基因表达的调控。磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)是其活化形式，一些生长因子、细胞因子及肿瘤启动子通过Ras/Raf/MEK/ERK途径磷酸化激活ERK1/2，活化的ERK1/2(P-ERK1/2)将胞浆内信号导入胞核，作用于c-jun、c-fos、c-Myc、ElK-1等转录因子及核蛋白，促进多种癌基因及细胞周期调节相关基因的转录与表达。P-ERK1/2通路异常活化提示肿瘤细胞的生物学性质较为活跃，表现为肿瘤细胞增殖加快，容易发生侵袭和转移，对化疗、放疗的敏感性降低，患者生存时间缩短[11]。研究发现RAS→RAF→MAPK细胞信号转导通路激活与恶性肿瘤的发生发展和恶性程度密切相关，贯穿在肿瘤发展的各个阶段[12]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内最重要的信号转导通路之一，调节细胞的有丝分裂、基因表达。MAPKs是一个蛋白激酶家族，在哺乳动物中发现了5条并行的信号通路，其中ERK1/2级联通路被认为是经典的MAPKs信号转导通路之一。既往的临床研究表明，糖尿病(尤其是2型糖尿病)与多种肿瘤的发生密切相关[13]。事实上，荟萃分析已经证实2型糖尿病是几种不同类型肿瘤发展的独立危险因素。Larsson等[14]的研究结论支持糖尿病患者的结直肠癌风险高于非糖尿病患者。Ren等[15]研究结果显示，在7 938例2型糖尿病患者中就有64例患有结直肠癌(44例结肠癌和20例直肠癌)，其粗发病率为314.8/10万，其发病率显著高于普通人群。本研究结果显示，CRC/DM组的癌组织中P-ERK1/2阳性表达率为41.4%，CRC组的癌组织中P-ERK1/2阳性表达率为16.6%，CRC/DM组中P-ERK1/2的表达率明显高于CRC组，提示2型糖尿病结直肠癌的发生可能与P-ERK1/2的过表达密切相关，进一步证明磷酸化的细胞外信号调节激酶 1/2蛋白在合并2型糖尿病CRC的发生发展中起重要作用。本研究结果与相关研究结论[12]一致。

在许多研究中提示RAS→RAF→MAPK信号通路可能直接或间接与女性激素相关，女性激素对乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等致病因素已有定论[16]。本研究提示P-ERK1/2磷酸化高表达与肿瘤的性别差异有相关性。不考虑患者有无糖尿病，在所有病例女性患者中P-ERK1/2阳性表达率为45.5%，男性为18.9%，女性组P-ERK1/2阳性表达率明显高于男性组。但女性激素是否也是结直肠癌的发病因素，尚需大量临床试验数据进一步验证。另外，本研究结果显示：P-ERK1/2表达与有无淋巴结转移密切相关：无淋巴结转移组P-ERK1/2阳性表达率明显高于有淋巴结转移组。提示P-ERK1/2在无淋巴结转移的结直肠癌人群中检测更有意义，一旦发生淋巴结转移，该指标可能检测意义不大。由于本样本量较小，在今后的研究中需要进一步加大样本量完成机制方面的研究。

Meyerhardt等[17]的研究显示，结直肠癌合并2型糖尿病的患者与无糖尿病相比，其结直肠癌的治愈率更低，总体生存率更低，复发率较高，结直肠癌合并糖尿病组的平均生存时间比对照组少5.3年。Dehal等[18]对2 278例转移性结直肠癌患者进行了10多年的随访，结果显示，合并2型糖尿病患者的死亡风险明显高于非糖尿病患者。其机制可能为2型糖尿病的高胰岛素血症可通过影响胰岛素-胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor-1,IGF-1)轴以及胰岛素样生长因子结合蛋白增加血清IGF-1水平，该因子可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，与结直肠癌的患病风险有关。之前笔者曾经做过研究显示：IGF1R和Ras蛋白在CRC/DM组患者癌组织中的阳性表达率均明显高于CRC组，并且具有IGF1R+ Ras+免疫表型患者所占的比例明显高于CRC组，二者的表达呈正相关[19]。提示IGF1R/Ras通路可能在合并2型糖尿病CRC的发生发展中起重要作用。我们通过对P-ERK1/2信号下游及IGF1R+ 信号下游的分子进行比对，发现有大多数的共同信号分子：Ras基因，MEK，ERK1/2等，所以我们有理由相信P-ERK1/2与IGF1R+ 信号通路存在着某种联系，共同参与了结直肠癌的发展。另外，本研究结果显示，在CRC组的患者术后的中位生存时间是26个月，CRC/DM组的患者术后的中位生存时间是19个月，二者差异有统计学意义(P=0.0304，P<0.05) 。在CRC组患者术后36个月内有40%(12/30)死亡，CRC/DM组患者术后36个月内有79.3%(23/29)死亡，二者差异有统计学意义(P<0.05)。我们的研究结果与相关研究结果一致[15]：结直肠癌合并2型糖尿病组的患者与单纯结直肠癌组患者相比，其总体生存时间较低，病死率较高。这说明2型糖尿病可能通过不同的通路参与了结直肠癌的发展。故临床上应重视2型糖尿病患者的结直肠癌筛查，Nagel等[20]建议，2型糖尿病患者应定期进行结肠镜检查，时间间隔不超过5年。重要的是血糖控制也是结直肠癌患者管理的根本策略，通过对血糖良好的控制，使结直肠癌患者有更多的获益。由于样本量较少，本研究存在一定程度的局限性，今后有必要进一步增大样本量来探讨2型糖尿病对CRC发生发展的影响，并加强机制方面的研究，以期为临床诊疗及预后评估提供更有价值的参考。

CRC/DM组磷酸化的细胞外信号调节激酶 1/2蛋白表达明显高于CRC组，磷酸化的细胞外信号调节激酶 1/2蛋白可能参与了2型糖尿病患者发生CRC的过程；不考虑糖尿病，在所有59例病例中，女性组P-ERK1/2阳性表达率明显高于男性组，无淋巴结转移组P-ERK1/2阳性表达率明显高于有淋巴结转移组；2型糖尿病合并结直肠癌组患者与单纯结直肠癌组患者相比，其总体生存时间较低，病死率较高。