王霞 桑飞 郭鑫 李伟

慢性盆腔炎是女性生殖系统常见的疾病之一，其发病机制与免疫因素、环境因素及年龄等多种原因有关[1]，由于目前临床中经常应用的药物治疗方案效果并不理想且复发率高，所以对于慢性盆腔炎治疗药物的研发仍是当前工作重点。赤芍总苷是从中药材赤芍中提取得到的多种单萜苷类化合物的总称，已有的研究发现赤芍总苷具有抗肿瘤、抗血栓、抗炎等多种药理作用[2-4]。NF-κB作为调节体内炎性反应的关键通路，其在慢性盆腔炎等多种妇科炎症疾病发病过程中关键作用[5,6]。本实验通过研究赤芍总苷对于慢性盆腔炎大鼠的炎症抑制作用及对NF-κB通路的调节作用，旨在为赤芍总苷的药理作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠[由新疆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2018-0002)]，雌性，7～8周龄，体重200～240 g，自由饮食，饲养于动物房。

1.2 药品与试剂 赤芍总苷(西安泽邦生物科技有限公司，批号2020040321)；妇炎康(湖南湘泉制药有限公司，批号2019121101)；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及解脲脲原体菌菌株(上海雅吉生物科技有限公司)；白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、细胞黏附分子1(ICAM-1)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)大鼠酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒、NF-κBp65及GAPDH兔单克隆抗体、IκKα兔多克隆抗体、ECL发光试剂盒、SYBR Green qPCR Mix试剂盒(碧云天生物科技公司，货号PI328、PT516、PT878、PI495、PI615、PI525、S0103、S0131M、AF1234、AF1186、AF0198、P0018M、D7260)；IL-13(北京索莱宝科技有限公司，货号SEKR-0046)；CD3、CD4、CD8荧光标记抗体(赛默飞世尔科技有限公司，货号13-0037-82、13-0041-82、MA5-17595)；HE染色液(武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G1005-500ML)，TransZol(北京全式金生物科技公司，货号ET101-01)，PCR引物设计及合成(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

1.3 设备及仪器 Eclipse E100显微镜(日本Nikon公司)；Omega Fluor凝胶成像系统凝胶成像仪(美国Aplegen)；ELX800全自动酶标仪(北京泰泽嘉业科技发展有限公司)；RM2016轮转式切片机(德国Leica公司)；Allegra X-15R台式冷冻离心机(贝克曼库尔特商贸有限公司)；Attune NxT流式细胞仪(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.4 造模、分组与给药 72只大鼠随机分为正常对照组、慢性盆腔炎组、赤芍总苷低、中、高剂量组及妇炎康组，12只/组，除正常对照组，其余大鼠参照文献方法[7]，将含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及解脲脲原体菌混合菌液的医用明胶经阴道塞至左右宫腔内，各1片，将大鼠倒立3 min。隔天1次，连续3次，随机取3只大鼠取子宫组织进行病理学检查，以大鼠子宫组织出现明显炎性浸润及组织结构病理性改变视为造模成功。赤芍总苷低、中、高剂量组分别灌胃给予50、100、200 mg/kg[8]的赤芍总苷，妇炎康组给予420 mg/kg[9]的妇炎康，正常对照组及慢性盆腔炎组给予0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续21 d[9]。

1.5 观察指标

1.5.1 血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1测定 腹腔注射给予大鼠40 mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，腹主动脉采血，4℃静置2 h，3 500 r/min离心10 min，采用ELISA试剂盒检测血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平。

1.5.3 子宫组织IL-4、IL-10、IL-13、SOD、MDA测定：大鼠处死后分离子宫组织，匀浆后离心，使用相应ELISA试剂盒测定子宫组织IL-4、IL-10、IL-13水平，WST-8法测定SOD水平，显色法测定MDA水平。

1.5.4 HE染色：分离大鼠子宫组织，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，厚度为5 μm。切片用苏木精染色5 min，蒸馏水洗净，伊红染色5 min，脱水后用中性树脂封闭，在显微镜下观察子宫组织形态。

1.5.5 RTq-PCR检测大鼠子宫组织NF-κBp65及IκKα mRNA水平：取子宫组织提取RNA，用TransZol试剂提取总RNA，用试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。根据说明书方法，使用SYBR Green qPCR Mix试剂盒进行RTq-PCR。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算表达量。见表1。

表1 RTq-PCR各基因引物序列

1.5.6 Western blot：子宫组织加入裂解液，用匀浆器以3 000 r/min的速度匀浆60 s，在4℃，12 000 r/min的条件下离心10 min，收集上清液，得到总蛋白溶液，电泳分离，将蛋白转移到聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，经1∶500稀释后的NF-κBp65、IκKα及GAPDH抗体孵育过夜，次日经含吐温磷酸盐缓冲液洗涤后，将膜置于二抗在室温下孵育30 min，再次洗涤后，取出条带滴加显影液，并使用凝胶分析系统及ImageJ软件进行灰度值分析。

2 结果

2.1 赤芍总苷对慢性盆腔炎大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1的影响 与正常对照组比较，慢性盆腔炎组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平升高(P<0.05)；与慢性盆腔炎组大鼠比较，赤芍总苷低、中、高剂量组及妇炎康组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平降低(P<0.05)，且随着赤芍总苷剂量的增加，大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平逐渐降低。见表2。

表2 大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平

2.2 赤芍总苷对大鼠子宫组织IL-4、IL-10、IL-13、SOD、MDA的影响 与正常对照组比较，慢性盆腔炎组大鼠子宫组织IL-4、IL-10、IL-13、SOD水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)；与慢性盆腔炎组比较，赤芍总苷低、中、高剂量组及妇炎康组大鼠子宫组织IL-4、IL-10、IL-13、SOD水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，且赤芍总苷不同剂量组内比较，差异亦有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 大鼠子宫组织IL-4、IL-10、IL-13、SOD水平

2.3 赤芍总苷对慢性盆腔炎大鼠子宫组织病理形态学影响 病理形态学检查结果表明，正常对照组大鼠子宫组织腺体结构正常，未见充血和水肿；慢性盆腔炎组大鼠子宫内膜变薄，结构紊乱，大量炎性细胞浸润，子宫内膜充血水肿；与慢性盆腔炎组比较，赤芍总苷低、中、高剂量组及妇炎康组大鼠黏膜上皮细胞排列整齐，子宫内膜充血水肿明显减轻，炎性细胞浸润减轻，子宫病变有所恢复。见图1。

正常对照组慢性盆腔炎组赤芍总苷低剂量组赤芍总苷中剂量组赤芍总苷高剂量组妇炎康组

表4 大鼠外周血细胞水平

2.5 赤芍总苷对慢性盆腔炎大鼠子宫组织NF-κBp65及IκKα mRNA水平影响 与正常对照组比较，慢性盆腔炎组大鼠子宫组织NF-κBp65mRNA水平升高(P<0.05)，IκKα mRNA水平降低(P<0.05)；与慢性盆腔炎组比较，赤芍总苷低、中、高剂量组及妇炎康组大鼠子宫组织NF-κBp65mRNA水平降低(P<0.05)，IκKα mRNA水平升高(P<0.05)，且随着赤芍总苷剂量的增加，大鼠子宫组织NF-κBp65mRNA水平逐渐降低，IκKα mRNA水平逐渐升高。见表5。

表5 大鼠子宫组织NF-κBp65及IκKα mRNA水平

2.6 赤芍总苷对慢性盆腔炎大鼠子宫组织NF-κBp65及IκKα蛋白表达的影响 与正常对照组比较，慢性盆腔炎组大鼠子宫组织NF-κBp65水平升高(P<0.05)，IκKα 水平降低(P<0.05)；与慢性盆腔炎组比较，赤芍总苷低、中、高剂量组及妇炎康组大鼠子宫组织NF-κBp65水平降低(P<0.05)，IκKα水平升高(P<0.05)，且随着赤芍总苷剂量的增加，大鼠子宫组织NF-κBp65水平逐渐降低，IκKα水平逐渐升高。见图2，表6。

图2 赤芍总苷对慢性盆腔炎大鼠子宫组织NF-κBp65及IκKα蛋白表达的影响

表6 大鼠子宫组织NF-κBp65及IκKα蛋白水平比较

3 讨论

慢性盆腔炎作为女性常见的内生殖器及盆腔腹膜慢性炎症之一，是由于机体免疫力下降，同时细菌及病毒等感染引起[11]，临床表现为下腹胀痛、月经紊乱以及发热等全身症状，并可能会对女性生育能力造成一定程度的影响。近年来研究发现，慢性盆腔炎与宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等多种妇科肿瘤疾病的发生发展相关[12,13]。混合菌接种法是目前实验室建立慢性盆腔炎动物模型的主要方法之一[14]，该方法简单易行，成功率高，并且与人类慢性盆腔炎疾病进展相似，故本实验采用此种方法建立大鼠模型。妇炎康是目前临床中应用的治疗慢性盆腔炎的药物之一[15]，本实验用其作为阳性对照药物。

近年来研究发现赤芍总苷具有较强的抗炎及抗氧化应激等多种药理作用[4]，肖文豪等[16]研究表明，赤芍总苷能够降低大鼠超敏C-反应蛋白水平，并升高一氧化氮水平，进而改善自发性高血压大鼠体内炎症水平；杨霞等[17]研究发现赤芍总苷能够通过促进炎性T细胞凋亡，抑制扁平苔藓患者体内炎症的发生发展；高雪岩等[18]报道了赤芍总苷具有显著的抗氧化损伤及自由基清除作用，进而发挥其较强的抗炎作用，由此可见赤芍总苷具有较强的抗炎性反应的潜力。

IL-6及TNF-α作为体内重要的炎性因子[19]，在慢性盆腔炎的发病过程中起着重要作用；TGF-β1作为免疫抑制因子，能够抑制体内免疫活性细胞的增殖，进而加速炎性反应的速度及进展[20]；ICAM-1是介导黏附反应重要黏附分子，能够促进白细胞、炎性细胞等在炎症部位的黏附性增强[21]。谢紫烨等[22]研究表明慢性盆腔炎大鼠血清及子宫组织内IL-6及TNF-α水平升高，并表明其在慢性盆腔炎的疾病进展中起到促进作用。Zhang等[23]研究表明TGF-β1及ICAM-1水平在慢性盆腔炎大鼠体内明显升高，而抑制其水平的升高能够明显抑制炎性反应进展，并促进炎性细胞凋亡。

IL-4、IL-10、IL-13作为抗炎性因子，其水平的降低是慢性盆腔炎发病及进展的重要影响因子，提高IL-4、IL-10、IL-13水平能够降低慢性盆腔炎大鼠炎性反应[26]，改善预后。

SOD及MDA水平是体内氧化应激损伤的标志物，SOD水平降低及MDA水平升高均会诱导或加重氧化损伤[27]，进而促进体内炎性介质的产生，段杨平等[28]指出慢性盆腔炎患者体内SOD水平明显降低，MDA水平升高，而使用逍遥丸则能够升高SOD水平，降低MDA水平，提高慢性盆腔炎患者的治愈率。本实验结果表明，赤芍总苷能够通过调节体内炎性因子及抗炎性因子的水平，抑制子宫组织氧化应激损伤，进而抑制慢性盆腔炎大鼠疾病进展。

已有大量文献表明，NF-κB在慢性盆腔炎等炎症性疾病的发病过程中起重要作用，机体受到细菌、病毒等病原体感染后，NF-κB作为炎性反应的中心介质，可以被各种病原体激活，并调节免疫反应中涉及的促炎细胞因子的水平[29]。因此，抑制NF-κB通路相关蛋白的激活，降低炎性因子水平，可能是慢性盆腔炎的潜在治疗靶点。谷风等[30]研究表明慢性盆腔炎大鼠子宫组织NF-κBp65蛋白水平升高，IκKα表达降低，而抑制慢性盆腔炎大鼠体内NF-κBp65水平，提高IκKα水平则促进了炎性细胞的凋亡，抑制盆腔炎症的发生；吕耀中等[31]也报道了慢性盆腔炎大鼠体内NF-κBp65的异常激活参与子宫组织炎性反应及纤维化发生发展，而抑制NF-κBp65能够抑制慢性盆腔炎大鼠细胞外基质合成，促进纤维化修复。本实验结果表明，与慢性盆腔炎大鼠比较，赤芍总苷低、中、高剂量组及妇炎康组大鼠子宫组织NF-κBp65mRNA水平及蛋白表达降低，IκKα mRNA水平及蛋白表达升高，这提示赤芍总苷能够呈剂量依赖性地抑制NF-κB的过度激活，进而抑制慢性盆腔炎大鼠体内炎性反应进展。

综上所述，赤芍总苷能够明显降低慢性盆腔炎大鼠子宫组织炎性水平，并提高抗炎性因子水平，改善子宫组织病理变化，其机制可能与调节NF-κB通路有关。