文利伟 张诚 李建明 沈洪波

脑胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤边缘境界不清，不易切除，且切除后易复发，给患者造成沉重的经济和心理负担[1]。随着科学的发展，靶向治疗成为胶质瘤治疗的热点及新方向[2]。研究表明lncRNA对神经胶质瘤的发生发展和其他恶性表型至关重要，可作为潜在的新型生物标志物和治疗靶标[3]。研究报道LINC00240与食管鳞状细胞癌有关[4]。LINC00240在胃癌组织和细胞中高表达，下调LINC00240通过调控miR-124-3p/DNA甲基转移酶3B(DNA-methyltransferase-3B，DNMT3B)轴可抑制细胞增殖，侵袭和迁移，并且在体内可显著抑制胃癌细胞的肿瘤发生[5]。然而LINC00240对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响笔者所见尚不清楚。有研究报道神经胶质瘤细胞系和组织中miR-656表达明显下调；miR-656过表达通过抑制BMP受体1A型(BMP receptor type 1A，BMPR1A)抑制神经胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭[6]。lncRNA NORAD通过吸附miR-656-3p促进非小细胞肺癌的增殖和迁移[7]。但miR-656-3p对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及LINC00240是否调控miR-656-3p影响胶质瘤进展尚不清楚。因此，本实验旨在研究LINC00240是否通过调控miR-656-3p影响胶质瘤细胞增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料 正常人类神经胶质细胞HEB，胶质瘤细胞系LN18、SW1088、Hs683购自ATCC；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂、荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；蛋白裂解液、BCA试剂盒购自美国Biomiga公司；MTT试剂盒购自日本同仁研究所；凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国biovision公司。

1.2 细胞处理与分组 正常的人类神经胶质细胞HEB和胶质瘤细胞系LN18、SW1088、Hs683用RPMI-1640培养液常规培养；取对数生长期细胞LN18，将si-NC、si-LINC00240、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00240、miR-NC、miR-656-3p转染至细胞LN18中，分别记为si-NC组、si-LINC00240组、pcDNA-NC组、pcDNA-LINC00240组、miR-NC组、miR-656-3p组；将si-LINC00240分别与anti-miR-NC、anti-miR-656-3p共转染至细胞LN18中，记为si-LINC00240+anti-miR-NC组、si-LINC00240+anti-miR-656-3p组。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LINC00240、miR-656-3p的表达水平 Trizol试剂提取细胞总RNA，合成cDNA，按试剂盒说明进行PCR，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.4 Western blot法检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白进行转膜，封闭，分别加入一抗和二抗孵育，抗体孵育结束后加入ECL发光液进行显影，最后用Quantity One分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参计算蛋白相对表达水平。

1.5 MTT检测细胞活性 细胞培养48 h，加入MTT溶液，孵育后检测490 nm处吸光度(OD)。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，按试剂盒说明操作；上流式细胞仪检测。

1.7 双荧光素酶报告实验 构建野生型和突变型的LINC00240荧光素酶报告载体，将其分别与miR-NC和miR-656-3p共转染至LN18细胞中，按试剂盒说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 胶质瘤细胞系中LINC00240和miR-656-3p表达情况 胶质瘤细胞系LN18、SW1088、Hs683中LINC00240表达水平高于正常人HEB，而miR-656-3p表达水平低于HEB(P<0.05)。见表1。

表1 胶质瘤细胞系中miR-656-3p和LINC00240表达量

2.2 LINC00240低表达对LN18胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC组比较，si-LINC00240组CyclinD1表达水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平升高，LN18细胞活性降低，凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2。

图1 LINC00240低表达对LN18胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响；A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表2 LINC00240低表达对LN18胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

2.3 miR-656-3p高表达对LN18胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-656-3p组LN18细胞中CyclinD1表达水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平升高，LN18细胞的活性降低，凋亡率升高，5个指标的组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3，图2。

表3 miR-656-3p高表达对LN18胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

图2 CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.4 LINC00240靶向miR-656-3p LncBase Predicted v.2在线软件预测显示，miR-656-3p和LINC00240存在结合位点。miR-656-3p与LINC00240野生型报告质粒共转染的细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)。与pcDNA-NC比较，pcDNA-LINC00240组miR-656-3p表达水平降低，与si-NC比较，si-LINC00240miR-656-3p表达水平升高(P<0.05)。见图3，表4、5。

图3 LncBase Predicted v.2对miR-656-3p和LINC00240结合进行预测示意图

2.5 低表达miR-656-3p可以逆转LINC00240低表达对LN18增殖和凋亡的影响 与si-LINC00240+anti-miR-NC组相比，si-LINC00240+anti-miR-656-3p组CyclinD1表达水平升高，Cleaved-caspase-3表达水平降低，LN18细胞活性升高，凋亡率降低(P<0.05)。见图4，表6。

表4 双荧光素酶活性检测

表5 qRT-PCR检测miR-656-3p的表达

图4 CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表6 低表达miR-656-3p可以逆转LINC00240低表达对LN18增殖和凋亡的影响

2.6 NF-κB信号通路相关蛋白的表达 与si-NC组比较，si-LINC00240组p-p65、p-IкBα表达水平降低(P<0.05)；与si-LINC00240+anti-miR-NC组比较，si-LINC00240+anti-miR-656-3p组p-p65、p-IкBα表达水平升高(P<0.05)。见图5，表7。

图5 Western Blot检测p-p65、p-IкBα蛋白的表达

表7 NF-κB信号通路相关蛋白的表达

3 讨论

研究表明lncRNA参与调控胶质瘤的发生发展过程[8,9]。研究报道LINC00240在宫颈癌中表达增加，LINC00240增强了宫颈癌细胞的生长，迁移和侵袭；LINC00240过表达通过影响miR-124-3p/信号转导和转录激活因子3(STAT3)/MHC I类相关链A(MICA)轴抑制了自然杀伤性T细胞的细胞毒活性[10]。本实验结果显示，与正常人类神经胶质细胞HEB相比，胶质瘤细胞系LN18、SW1088、Hs683中LINC00240表达水平升高；低表达LINC00240后胶质瘤细胞系LN18中CyclinD1的表达水平降低，LN18细胞活性降低，而凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3的表达水平升高，LN18细胞的凋亡率升高。表明抑制LINC00240表达可抑制胶质瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。

另外，miRNA也可能与lncRNA相互作用并影响肿瘤的生长和发展[11]。有研究报道抑制lncRNA ANRIL可通过调节miR-656-3p/Y染色体上的性别决定区相关高迁移率族盒蛋4(SOX4)轴来提高非小细胞肺癌对顺铂的敏感性[12]。lncRNA PCAT1通过海绵miR-656和miR-539上调Yes相关蛋白(YAP)来促进透明细胞肾细胞癌细胞的增殖，迁移和侵袭[13]。本实验结果显示，胶质瘤细胞系中miR-656-3p表达水平降低，miR-656-3p高表达可抑制胶质瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。且LINC00240靶向miR-656-3p，低表达miR-656-3p可以逆转LINC00240低表达对LN18细胞增殖、凋亡的影响。提示，LINC00240可能通过调控miR-656-3p影响胶质瘤细胞增殖、凋亡。

有研究报道核因子-κB(NF-κB)信号通路的异常激活与神经胶质瘤的生物学特性改变密切相关，可为神经胶质瘤治疗提供新的思路和靶点[14]。干扰转录激活因子5(ATF5)可下调NF-κB信号通路降低脑胶质瘤细胞的活力，诱导细胞凋亡[15]。阻断LINC00152可以通过miR-612/AKT2/NF-κB通路损害间充质表型来抑制胶质母细胞瘤的恶性程度[16]。本实验结果显示，LINC00240低表达后p-p65、p-IкBα表达水平降低，表明低表达LINC00240可抑制NF-κB信号通路。而低表达miR-656-3p可以逆转LINC00240低表达对NF-κB信号通路的影响。

综上所述，低表达LINC00240可能通过上调miR-656-3p调控NF-κB信号通路进而抑制胶质瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。