张莉 华毛 刘浩明

鼻咽癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，早期患者治疗以放疗为主，对于中晚期以及复发转移性患者，放疗无法彻底根除肿瘤，随着对鼻咽癌发病机制的深入研究，分子靶向治疗可能是提高鼻咽癌疗效的有效策略[1,2]。研究表明miRNA影响鼻咽癌的发生和发展，其可作为肿瘤基因治疗的靶点，针对miRNA寻找靶向治疗的新方法，可为鼻咽癌的治疗开辟一条新的途径[3]。研究报道miR-493-5p通过靶向Kruppel样因子5(Kruppel-like factor 5，KLF5)抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡[4]。miR-493-5p过表达促进肝癌细胞凋亡并抑制肝癌细胞的增殖和迁移[5]。过表达miR-493-5p可以抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。然而miR-493-5p对鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响还尚未可知。METTL3是一种mRNA甲基转移酶，在多种恶性肿瘤中异常表达；如METTL3在非小细胞肺癌中高表达，与患者预后不良相关[7]。METTL3高表达促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移[8]。METTL3在鼻咽癌中高表达，通过介导EZH2的M6A修饰来促进鼻咽癌的进展[9]。因此，本实验研究miR-493-5p对鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及miR-493-5p是否通过靶向调控METTL3影响鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2019年8月我院病理科存档且已确诊鼻咽癌的组织标本40例，其对应距离癌组织边缘5 mm处切除的癌旁组织作为对照，患者手术切除癌组织，癌患者手术前未进行过手术及放化疗，患者均知情且同意。

1.2 细胞与主要试剂 鼻咽癌5-8F细胞购自上海沪峥生物科技有限公司；RPMI-1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；抗体购自上海煊翎生物技术有限公司；细胞计数试剂盒8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国AAT Bioquest公司；Transwell小室、Matrigel购自美国BD公司；METTL3抗体(orb622739)购自英国biorbyt公司；CyclinD1(PL0502539)、p21(PL0502562)、MMP-2(PL0304135)、MMP-9抗体(货号：PL0304134)购自加拿大PLLABS公司。

1.3 细胞培养与分组 鼻咽癌5-8F细胞用RPMI-1640培养液培养；取对数生长期细胞，将其稀释为3×105/ml的密度，接种于6孔板中培养，待细胞融合达到80%时；取0.5 μg的miR-493-5p mimics、miR-493-5p inhi币投入(anti-miR-NC)及其阴性对照、METTL3干扰质粒及其阴性对照质粒，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成稀释液，终体积为25 μl；取1 μl的转染试剂，然后加入24 μl无血清稀释液体，充分混匀，室温静置5 min；将上述两种溶液混合，室温静置15 min；将上述复合物加入到5-8F细胞中共培养，混合均匀；培养6 h后更换新鲜培养液，记为miR-NC组、miR-493-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-493-5p组、si-NC组、si-METTL3组；将miR-493-5p mimics分别与pcDNA、pcDNA-METTL3共转染至5-8F细胞中，记为miR-493-5p+pcDNA组、miR-493-5p+pcDNA-METTL3组。miR-493-5p mimics序列：CTACTGTGTGCCAGGCC；miR-NC序列：GCTTTCATACATGTGGTAG；anti-miR-493-5p序列：GGCTTTCGTACTCTGGCCA；anti-miR-NC序列：TCGTGTTCATTCAGCACA；si-METTL3序列：GCTGAACATACCCGTACTATT；si-NC序列：TTCTCCGAACGTGTCACGTTT。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-493-5p和METTL3 mRNA表达水平 miR-493-5p上游引物序列：5’-TTGTACATGGTAGGCTTTCATT-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；METTL3上游引物序列：5’-GAGGAGTGCATGAAAGCCAG-3’，下游引物序列：5’-GGCCTCAGAATCCATGCAAG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TCTCCTCTGACTTCAACAAGCGACA-3’，下游引物序列：5’-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。提取组织及细胞总RNA，反转录成cDNA，按SYBR Premix ExTaqTM试剂盒说明进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。miR-493-5p和METTL3分别以U6和GAPDH为内参。

1.5 蛋白质印迹(Western blot)法检测METTL3、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表达 提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒进行定量；蛋白样品于10%的SDS-PAGE进行电泳，转至PVDF膜上，用5 %的牛血清蛋白封闭1 h。加入一抗(稀释比例1∶800)4℃过夜，TBST洗膜3次；加入二抗(稀释比例1∶1 000)室温培养1 h，加入化学发光液显影，分析各蛋白条带灰度水平，以目的条带和GAPDH条带的灰度值比值作为目的蛋白相对表达水平。

1.6 CCK-8检测细胞增殖活性 取对数生长期细胞，将其稀释为3×105/ml的密度，接种于6孔板，培养24 h、48 h、72 h，严格按试剂盒说明操作，每孔中加入10 μl CCK-8试剂，在培养箱中孵育2 h后，用酶标仪检测490 nm处的吸光度值(OD)；以OD值代表细胞活性。

1.7 Transwell检测细胞迁移和侵袭 将细胞用无血清培养基以5×105细胞/ml的密度悬浮，迁移实验：取600 μl含血清培养液和100 μl无血清培养后的细胞悬液，将其分别置于Transwell下室和上室，培养24 h，去除培养液，多聚甲醛固定30 min，加入0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下随机观察5个视野计数，取其平均值即为迁移细胞数；侵袭实验除用Matrigel包被Transwell上室，其余与细胞迁移操作相同。

1.8 荧光素酶报告实验检测miR-493-5p和METTL3的靶向关系 构建METTL3野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-METTL3和MUT-METTL3，将其分别与miR-NC和miR-493-5p共转染至5-8F细胞中；按照说明书检测荧光素酶强度，用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶强度的比值计算相对荧光素酶的活性。

2 结果

2.1 miR-493-5p和METTL3在鼻咽癌组织中的表达 与癌旁组织相比，鼻咽癌组织中miR-493-5p表达水平降低，METTL3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 METTL3蛋白表达

表1 miR-493-5p和METTL3在鼻咽癌组织中的表达

2.2 miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移侵袭的影响 与miR-NC组相比，miR-493-5p组鼻咽癌5-8F细胞中miR-493-5p表达水平升高，细胞活性降低，细胞迁移、迁袭数降低，鼻咽癌5-8F细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平降低，而p21表达水平升高(P<0.05)。见图2，表2。

图2 miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移侵袭的影响(结晶紫染色×200)；A 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达；B miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞迁移侵袭的影响

表2 miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移侵袭的影响

2.3 抑制METTL3表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移侵袭的影响 与si-NC组相比，si-METTL3组METTL3表达水平降低，细胞活性降低，细胞迁移、迁袭数降低，鼻咽癌5-8F细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平降低，而p21表达水平升高(P<0.05)。见表3，图3。

表3 抑制METTL3表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移侵袭的影响

2.4 上调METTL3表达逆转了miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移侵袭的作用 与miR-493-5p+pcDNA组相比，miR-493-5p+pcDNA-METTL3组鼻咽癌5-8F细胞中METTL3表达水平升高，5-8F细胞活性升高，5-8F细胞迁移、迁袭数升高，鼻咽癌5-8F细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平升高，而p21表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图4、5。

表4 上调METTL3表达逆转了miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移侵袭的作用

图4 上调METTL3表达逆转了miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞迁移侵袭的作用(结晶紫染色×200)

图5 METTL3和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.5 miR-493-5p靶向调控METTL3的表达 TargetScan预测显示 miR-493-5p与METTL3的3’UTR有互补的核苷酸序列。共转染WT-METTL3与miR-493-5p的5-8F细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，共转染MUT-METTL3与miR-493-5p的5-8F细胞荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)。与miR-NC组相比，miR-493-5p组METTL3蛋白表达水平降低，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-493-5p组METTL3蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6、7，表5、6。

图6 METTL3的3’UTR中含有与miR-493-5p互补的核苷酸序列

图7 METTL3蛋白表达

表5 双荧光素酶报告实验

表6 miR-493-5p调控METTL3蛋白的表达

3 讨论

鼻咽癌是一种特殊的头颈部肿瘤，好发于我国南部地区，近年来随着分子靶向治疗的发展，配合手术治疗、放化疗、靶向治疗等的综合治疗成为中晚期鼻咽癌的新的治疗方法[10]。研究表明miRNA参与了肿瘤的发生发展等过程，与患者预后相关。miR-493-5p的高表达与非小细胞肺癌患者的临床预后成正相关[11]。miR-493-5p在肝癌组织和细胞中表达下调，过表达miR-493-5p可通过调控高尔基体蛋白73(GP73)表达抑制肝癌细胞的增殖，促进细胞凋亡[12]。上调miR-493-5p表达通过靶向岩藻糖基转移酶Ⅳ(fucosyltransferase Ⅳ，FUT4)减弱乳腺癌的侵袭性和致瘤性[13]。本实验结果显示，鼻咽癌组织中miR-493-5p表达水平降低；过表达miR-493-5p后5-8F细胞活性降低，5-8F细胞迁移、迁袭数降低；说明过表达miR-493-5p可抑制鼻咽癌细胞增殖，迁移和侵袭。

研究报道鼻咽癌患者癌组织中METTL3高表达，METTL3促进了鼻咽癌细胞的迁移和侵袭[14]。高表达METTL3的鼻咽癌患者的预后较差，敲低METTL3抑制了鼻咽癌细胞的侵袭和迁移能力[15]。本实验结果显示，鼻咽癌组织中METTL3表达水平升高；抑制METTL3表达后5-8F细胞活性降低，5-8F细胞迁移、迁袭数降低，说明抑制METTL3表达可抑制鼻咽癌细胞增殖，迁移和侵袭；本实验结果与前人研究[14,15]结果相符。此外，还有研究报道miR-33a通过靶向下调METTL3表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖[16]。本实验用TargetScan预测miR-493-5p可能的靶mRNA，结果显示miR-493-5p与METTL3的3’UTR有互补的核苷酸序列，双荧光素酶报告实验证明miR-493-5p可靶向调控METTL3。且本实验还显示上调METTL3表达逆转了miR-493-5p过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

综上所述，过表达miR-493-5p可能抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其可能与下调METTL3表达有关。