王 佳 林雪容 高恒波 张志斌（河北北方学院附属第一医院急诊科，张家口 075000）

脓毒症是由感染引起的危重症，以全身炎症反应激活为特征，炎症因子大量释放并引发脓毒症性休克、多器官功能障碍，病死率较高，救治难度较大。心肌是脓毒症常见的受累脏器，多项动物实验证实脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡及炎症反应均呈过度激活状态，但调控脓毒症病程中心肌细胞凋亡及炎症反应的机制尚未阐明［1-2］。

微小RNA（microRNA，miR）是近年心血管领域研究热点，可在转录后水平调节多种基因表达并发挥生物学作用。研究表明，脓毒症患者外周血中miR-21表达减少且与脏器损伤、炎症反应激活及预后密切相关，提示miR-21低表达可能在脓毒症发生发展中起重要作用［3］。研究表明，心血管系统中miR-21 能够靶向程序性细胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）基因并抑制心肌缺血再灌注损伤过程中的细胞凋亡［4］；也可靶向CC趋化因子配体20（CC chemokine ligand 20，CCL20）基因并抑制心肌细胞炎症反应［5］；PDCD4 及CCL20 高表达与脓毒症患者炎症反应激活、脏器中细胞凋亡激活密切相关［6-7］。因此，课题组假设miR-21 可能靶向CCL20、PDCD4并抑制心肌细胞凋亡及炎症反应，miR-21在脓毒症发病过程中表达减少可能使其靶向作用减弱，进而激活心肌细胞凋亡及炎症反应。为验证以上假设，本研究具体分析miR-21 靶向CCL20 及PDCD4 对脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡及炎症反应的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞 成年雄性SD大鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0004；心肌H9c2 细胞株购自中科院上海细胞资源中心。

1.1.2 试剂与仪器 miR-21 mimic 及阴性对照（negative control，NC）mimic 购自上海吉玛公司；miR 提取分离试剂盒、miR cDNA 第一链合成试剂盒、miR 荧光定量检测试剂盒购自北京天根生物公司；cTnⅠ、CK-MB 检测试剂盒购自武汉明德生物公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β ELISA 试剂盒购自上海酶联生物公司；HE 染色试剂盒、一步法TUNEL 凋亡检测试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司；CCL20、PDCD4抗体购自Abcam公司；CCL20、PDCD4双荧光素酶报告基因及检测系统均购自Promega 公司，其中突变型CCL20、PDCD4双荧光素酶报告基因根据TargetScan生物信息学分析结果将miR-21 靶向结合的碱基进行突变；仪器荧光定量PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司；凝胶成像系统购自上海天能公司；显微镜购自日本Nikon 公司；离心机、细胞培养箱购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及干预 SD 大鼠随机分为对照组、脓毒症组、脓毒症+NC 组、脓毒症+miR-21 组，每组8 只。对照组进行假手术操作，脓毒症组、脓毒症+NC 组、脓毒症+miR-21 组采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症模型：腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.3 ml/kg），开腹并分离盲肠，在距离盲肠末端1 cm处用手术缝线结扎，用针头在结扎处穿过3次，肠管放回腹腔并逐层缝合切口。造模完成后，脓毒症组尾静脉注射生理盐水0.2 ml，脓毒症+NC 组尾静脉注射含20 μg NC mimic 的生理盐水0.2 ml，脓毒症+miR-21 组尾静脉注射含20 μg miR-21 mimic 的生理盐水0.2 ml。48 h 后处死大鼠，收集外周血及心肌组织。

1.2.2 miR-21 表达检测 取心肌组织约10 mg，采用miR 提取分离试剂盒提取心肌中miR，采用miR cDNA 第一链合成试剂盒将miR 反转录为cDNA，采用miR 荧光定量检测试剂盒配制PCR 反应体系：cDNA 1 μl、10 μmol/L 正反向引物各0.6 μl、反应混合液10 μl、去离子水7.8 μl，进行PCR反应：95℃预变性3 min，95℃5 s，60℃15 s，重复40 个循环，得到循环曲线及循环阈值（Ct），计算miR-21表达。

1.2.3 血清中cTnⅠ、CK-MB 含量检测 外周血3 000 r/min 离心10 min，分离血清，采用试剂盒检测cTnⅠ、CK-MB含量，按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 心肌HE 染色 取4%多聚甲醛固定的心肌组织，石蜡包埋，制作石蜡切片，HE 染色试剂盒染色，按照试剂盒说明书操作，染色完成后显微镜下观察心肌病理改变。

1.2.5 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡率 取心肌石蜡切片，采用一步法TUNEL 凋亡检测试剂盒进行染色，按照试剂盒说明书操作，染色完成后显微镜下观察TUNEL阳性染色细胞并计数，计算凋亡率。

1.2.6 ELISA 检测心肌中TNF-α、IL-1β 含量 取心肌组织约10 mg，加入RIPA 裂解液并充分匀浆，4℃、12 000 r/min 离心10 min，分离上清，采用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β 含量，BCA 试剂盒检测蛋白含量，计算每mg蛋白中TNF-α、IL-1β含量。

1.2.7 心肌中CCL20、PDCD4 表达检测 取心肌组织约10 mg，加入RIPA 裂解液并充分匀浆，4℃、12 000 r/min 离心10 min，分离上清，BCA 试剂盒检测蛋白含量，将含有20 μg 蛋白的上清样本与上样缓冲液混合后加入聚丙烯酰胺凝胶，电泳，电转移至NC 膜，5%脱脂牛奶室温封闭NC 膜1 h，4℃孵育1∶1 000 稀释的CCL20、PDCD4 抗体或1∶5 000 稀释的β-actin一抗过夜；第2天室温孵育1∶2 000稀释的HRP 二抗1 h，凝胶成像系统中曝光得到蛋白条带，根据条带灰度值计算CCL20、PDCD4表达。

1.2.8 双荧光素酶报告验证心肌H9c2 细胞中miR-21与CCL20、PDCD4靶向关系 H9c2细胞在含10%胎牛血清的DMEM 中培养，0.25%胰蛋白酶消化，接种于培养板，转染NC组转染NC mimic，miR-21组转染miR-21 mimic，24 h 后Western blot 检 测CCL20、PDCD4 表达；将野生型和突变型CCL20、PDCD4 双荧光素酶报告基因与NC mimic 或miR-21 mimic共同转染至细胞，24 h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光值、海肾荧光值，萤火虫荧光值/海肾荧光值比值作为双荧光素酶报告基因荧光活力。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，四组间比较采用方差分析，有统计学差异的资料进一步采用LSD-t法进行两两比较，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尾静脉注射miR-21 mimic 对脓毒症大鼠心肌中miR-21表达的影响 与对照组相比，脓毒症组大鼠心肌中miR-21表达明显减少（P＜0.05）；与脓毒症组相比，脓毒症+NC 组大鼠心肌中miR-21 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与脓毒症+NC 组相比，脓毒症+miR-21 组大鼠心肌中miR-21 表达明显增加（P＜0.05，表1）。

表1 4组大鼠心肌中miR-21表达比较（，n=8）Tab.1 Comparison of miR-21 expression in myocardium of rats in four groups（，n=8）

表1 4组大鼠心肌中miR-21表达比较（，n=8）Tab.1 Comparison of miR-21 expression in myocardium of rats in four groups（，n=8）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.2 尾静脉注射miR-21 mimic 对脓毒症大鼠血清cTnⅠ、CK-MB 含量的影响 与对照组相比，脓毒症组大鼠血清cTnⅠ、CK-MB含量明显增加（P＜0.05）；与脓毒症组相比，脓毒症+NC 组大鼠血清cTnⅠ、CK-MB 含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与脓毒症+NC 组相比，脓毒症+miR-21 组大鼠血清cTnⅠ、CK-MB含量明显减少（P＜0.05，表2）。

表2 4组大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB含量比较（，n=8）Tab.2 Comparison of serum cTnⅠand CK-MB contents in serum of rats in four groups（，n=8）

表2 4组大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB含量比较（，n=8）Tab.2 Comparison of serum cTnⅠand CK-MB contents in serum of rats in four groups（，n=8）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.3 尾静脉注射miR-21 mimic 对脓毒症大鼠心肌HE 染色的影响 对照组大鼠心肌纤维排列整齐，未见明显炎症细胞浸润；脓毒症组大鼠心肌纤维排列混乱，可见明显炎症细胞浸润（箭头所示）；脓毒症+NC 组大鼠心肌纤维排列混乱及炎症细胞浸润无明显改善；脓毒症+miR-21 组大鼠心肌纤维排列混乱及炎症细胞浸润均明显改善（图1）。

图1 4组大鼠心肌HE染色（×200）Fig.1 HE staining of myocardium of rats in four groups（×200）

2.4 尾静脉注射miR-21 mimic 对脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡率的影响 与对照组相比，脓毒症组大鼠心肌中细胞凋亡率明显提高（P＜0.05）；与脓毒症组相比，脓毒症+NC 组大鼠心肌中细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）；与脓毒症+NC 组相比，脓毒症+miR-21 组大鼠心肌中细胞凋亡率明显降低（P＜0.05，图2）。

图2 4组大鼠心肌细胞凋亡率比较（×400）Fig.2 Comparison of cell apoptosis rate in myocardium of rats in four groups（×400）

2.5 尾静脉注射miR-21 mimic 对脓毒症大鼠心肌中炎症因子含量的影响 与对照组相比，脓毒症组大鼠心肌中TNF-α、IL-1β 含量明显增加（P＜0.05）；与脓毒症组相比，脓毒症+NC 组大鼠心肌中TNF-α、IL-1β 含量变化无统计学意义（P＞0.05）；与脓毒症+NC 组相比，脓毒症+miR-21 组大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量明显减少（P＜0.05，表3）。

表3 4组大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量比较（，n=8，pg/mg）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β contents in myocar⁃dium of rats in four groups（，n=8，pg/mg）

表3 4组大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量比较（，n=8，pg/mg）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β contents in myocar⁃dium of rats in four groups（，n=8，pg/mg）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.6 尾静脉注射miR-21 mimic 对脓毒症大鼠心肌中CCL20、PDCD4 表达的影响 与对照组相比，脓毒症组大鼠心肌中CCL20、PDCD4表达明显增加（P＜0.05）；与脓毒症组相比，脓毒症+NC 组大鼠心肌中CCL20、PDCD4 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与脓毒症+NC 组相比，脓毒症+miR-21 组大鼠心肌中CCL20、PDCD4表达明显减少（P＜0.05，图3）。

图3 4组大鼠心肌中CCL20、PDCD4表达比较Fig.3 Comparison of CCL20 and PDCD4 expressions in myocardium of rats in four groups

2.7 心肌H9c2 细胞中miR-21 与CCL20、PDCD4 靶向关系验证 TargetScan 生物信息学分析显示，miR-21靶向CCL20基因mRNA 3'UTR第261～268碱基，靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR 第242～249 碱基（图4）。与NC组相比，miR-21组H9c2细胞中CCL20、PDCD4 表达明显减少，含野生型CCL20、PDCD4 基因mRNA 3'UTR双荧光素酶报告基因荧光活力明显降低（P＜0.05），但含突变型CCL20、PDCD4 基因mRNA 3'UTR 双荧光素酶报告基因荧光活力无明显变化（P＞0.05，图5、表4）。

图4 miR-21靶向CCL20、PDCD4的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of miR-21 targeting CCL20 and PDCD4

图5 2组H9c2细胞中CCL20、PDCD4表达比较Fig.5 Comparison of CCL20 and PDCD4 expressions in H9c2 cells among four groups

表4 2 组H9c2 细胞中CCL20、PDCD4 双荧光素酶报告基因荧光活力比较（，n=5）Tab.4 Comparison of fluorescence activity of CCL20 and PDCD4 double luciferase reporter genes in H9c2 cells between two groups（，n=5）

表4 2 组H9c2 细胞中CCL20、PDCD4 双荧光素酶报告基因荧光活力比较（，n=5）Tab.4 Comparison of fluorescence activity of CCL20 and PDCD4 double luciferase reporter genes in H9c2 cells between two groups（，n=5）

3 讨论

脓毒症可导致多器官功能障碍，其中心脏是常见受累脏器，但脓毒症患者发生心肌损伤或心功能障碍的机制尚未阐明。近年miRs 在心血管疾病中的诊疗价值备受关注，心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、病毒性心肌炎等疾病发生发展过程中均存在多种miRs 表达变化，miRs 异常表达不仅与病情及预后有关，还与心肌组织中细胞凋亡、炎症反应、氧化应激反应过程调控有关［8-10］。miR-21 是一类具有心血管保护作用的miR，心肌梗死、病毒性心肌炎患者外周血中miR-21 表达均明显减少［10-12］；NA 等［3］研究表明，脓毒症患者外周血中miR-21表达明显减少且与患者脏器损伤、炎症反应激活、预后密切相关，提示miR-21低表达可能参与脓毒症发生发展过程，与脓毒症病程中多脏器功能损伤有关。

为阐明miR-21 在脓毒症导致心肌损伤中的作用，本研究采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠模型，在心肌中检测到miR-21 表达减少，在血清中检测到cTnⅠ、CK-MB 含量增加，表明脓毒症大鼠出现心肌损伤，结合miR-21 的心血管保护作用分析，脓毒症大鼠心肌中miR-21 表达减少可能与心肌损伤有关。为进一步验证miR-21 与脓毒症大鼠心肌损伤的关系，本研究在脓毒症造模后通过尾静脉注射miR-21 mimic 的方式增加miR-21 表达，在心肌中检测到miR-21表达明显增加，在血清中检测到cTnⅠ、CK-MB含量明显减少，表明增加miR-21表达可减轻脓毒症大鼠心肌损伤，进而验证miR-21低表达与脓毒症大鼠心肌损伤有关。

脓毒症发病过程中心肌损伤与局部组织中细胞凋亡、炎症反应激活有关，炎症细胞大量浸润且炎症因子TNF-α、IL-1β分泌增多［13-14］。本研究显示，脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡率明显增加，炎症细胞大量浸润，且TNF-α、IL-1β分泌增多，与既往血清中细胞凋亡、炎症反应激活与脓毒症心肌损伤相关的研究结果相符。miR-21 在心血管系统中的保护作用与其抗凋亡、抗炎作用密切相关，本研究在脓毒症造模后尾静脉注射miR-21 mimic，过表达miR-21后观察到心肌中细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β 含量均降低，说明增加miR-21表达能够减轻脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡和炎症反应，可能是miR-21在脓毒症发病过程中发挥心肌保护作用的机制。

miR 发挥生物学作用的方式是与靶基因mRNA 3'UTR 结合，抑制靶基因表达并产生相应生物学效应，近年也有多项关于miR-21发挥生物学作用的研究。范丽等［4］研究表明，miR-21 通过靶向PDCD4 减轻心肌缺血再灌注过程中的细胞凋亡；XIAO 等［15］研究表明，心脏祖细胞来源外泌体分泌miR-21并靶向PDCD4，进而抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡；李阳春等［5］分析miR-21 的抗炎作用结果显示，miR-21 靶向CCL20 并减轻心肌细胞炎症，抑制心肌细胞凋亡。PDCD4 和CCL20 分别是介导细胞凋亡和炎症反应的基因，本研究显示，脓毒症大鼠心肌中PDCD4、CCL20 表达明显增加，而尾静脉注射miR-21 mimic后，心肌中PDCD4、CCL20表达明显减少，表明miR-21可能靶向抑制PDCD4、CCL20表达。说明靶向PDCD4、CCL20 是miR-21 在脓毒症的发病过程中减轻炎症反应和细胞凋亡并发挥心肌保护作用的可能机制之一，但同时体内也可能存在其他信号通路介导miR-21的上述心肌保护作用。

为阐明miR-21 在心肌中靶向PDCD4、CCL20 的作用，本研究在心肌H9c2细胞中进行了验证。采用TargetScan 进行生物信息学预测显示，PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 中存在miR-21 结合位点；将PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 的双荧光素酶报告基因转染至H9c2 细胞，miR-21 mimic 可使其荧光活力降低，但将双荧光素酶报告基因中生物信息学预测的miR-21 结合靶点进行突变后，miR-21 mimic 不再影响其荧光活力，表明miR-21 靶向PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 且具体结合靶点与TargetScan 生物信息学预测一致。miR-21 同时靶向PDCD4、CCL20基因mRNA 3'UTR，但具体靶向结合位点存在差异，miR-21 靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR 的 第242～249 碱基以及CCL20 基因mRNA 3'UTR的第261～268碱基。

综上，本研究动物实验及细胞实验结果表明miR-21 能够抑制脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡及炎症反应，分子机制可能为靶向抑制CCL2 及PDCD4表达，miR-21 有望成为脓毒症致心肌损伤的诊治靶点。