张维维 刘金倩 张全意

滨州医学院附属医院麻醉科 山东 滨州 256603

生物标志物是一种可以反应正常生物过程、病理过程或治疗干预的药理学结果的指标，可以被客观测量和评估。为了降低脓毒症患者的死亡率，早期诊断方法的研究对脓毒症具有重要的临床意义。目前，血液培养是脓毒症微生物诊断的金标准，但由于样本量小、确诊时间长和缺乏敏感性等原因，血液培养对脓毒症的诊断并不理想，导致治疗延迟和死亡率高[1-2]。现基于非编码RNA在脓毒症发病机制中的意义，多种长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在脓毒症患者和正常人血液中存在表达差异，且和脓毒症的严重程度或存活率相关，提示LncRNA可以作为脓毒症诊断和预后的候选标记物[3]。长链非编码RNA GASL1s(LncRNA GASL1 ) 是一种新发现的肿瘤抑制因子。除了恶性肿瘤以外，GASL1还和慢性充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)以及颅内动脉瘤相关。但是目前尚无关于GASL1和脓毒症关系的研究。在本部分研究中，我们通过收集检测脓毒症患者和检测对照血液中LncRNA GASL1的表达差异，分析血液GASL1对脓毒症患者的诊断价值。其次，通过在脓毒症患者中分析GASL1和脓毒症患者的特征、预后和并发症的关系，研究血液GASL1对脓毒症预后的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例来源于2018年1月至2018年12月我院重症监护室(intensive care unit，ICU)214例患者，其中伴有脓毒症者134例，不伴有脓毒症者80例。脓毒症患者的纳入标准如下：根据美国胸科医师学会/危重病医学会的标准诊断为败血症，患者年龄≥18岁。排除既往或患有实体癌，白细胞减少症，恶性血液病，严重慢性心、肝、肾、肺疾病，HIV感染性疾病，干细胞移植，3个月内用免疫抑制剂治疗，怀孕或哺乳期者。所有参与本研究的患者在研究前对本次实验目的及过程均有充分的了解，患者表示自愿参与本次研究,并签署知情同意书,符合医学伦理学要求并经伦理委员会审批通过。按照年龄和性别匹配从我院的健康筛查中心纳入120例健康对照者，并根据体检结果对纳入的健康对照者进行资格筛选。

1.2 病例信息收集 在病案信息系统中查询脓毒症患者的人口学资料、临床特征和实验室指标，包括年龄、性别、体质量指数(body mass index，BMI)。同时收集了健康对照组的体检信息资料，获得上述基本信息。所有患者的生命体征每天监测，常规治疗作为败血症的指导方针。

1.2.1 Lnc RNA GASL1表达水平的检测 血样收集脓毒症患者入院后24 h内采集血样，用于检测LncRNA GASL1的表达水平。此外，在获得知情同意后，每个健康对照者在健康筛查中心接受血液检测，并采集血液样本进行进一步检测。

1.2.2 急性生理学及慢性健康状况评分系统(acute physiology and chronic health valuation scoring system，APACHE)II和全身性感染相关性器官功能衰竭评分(sepsis related organ failure assessment，SOFA) APACHEⅡ由急性生理评分、年龄评分和慢性健康评分三部分组成，是目前临床上ICU病房应用最广泛、最具权威的危重病病情评价系统[4]。SOFA的主要目的是评价多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的发生、发展并评价发病率，评价指标包括六个器官的共11个指标[5]，次研究采用的SOFA值为患者住院期间的最大SOFA。APACHEⅡ和SOFA分数越高，患者的预后越差。

1.3 RT-PCR检测血液中LncRNA GASL1基因水平表达 将取得血液样品利用红细胞裂解液H、离心、裂解液、去蛋白液等方提取RNA溶液。然后通过反转录试剂盒将mRNA反转成cDNA，采用SYBRgreen试剂盒进行荧光定量检测。通过delta-delta CT方法计算相对mRNA达含量，并选择β-actin内参基因作为内参，通过熔解曲线分析产物的特异性。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 研究对象一般情况 ICU脓毒症患者和非脓毒症患者的性别、年龄、BMI、WBC、APACHEⅡ、SOFA等资料及健康对照者的性别、年龄和BMI资料见表1。通过统计分析比较显示脓毒症患者、非脓毒症患者和健康对照者的年龄、性别和BMI差异无统计学意义，脓毒症患者和非脓毒症患者APACHEⅡ评分的中位数、SOFA评分中位数的均值差异无统计学意义。

表2 研究对象的一般情况比较

2.2 血液LncRNA GASL1在不同组别患者中的表达 脓毒症患者、非脓毒症患者和健康对照者血液LncRNA GASL1的相对表达水平分别是(5.33±4.08)、(2.01±1.75)和(1.72±1.40)。方差分析结果表明血液GASL1在脓毒症患者、非脓毒症患者和健康对照者中的相对表达水平存在显著性差异，P<0.05。对三组之间进行两两比较显示，脓毒症患者血液中GASL1的相对表达水平显著高于非脓毒症患者，P<0.01。非脓毒症患者和健康对照者血液中的GASL1相对表达水平差异无统计学意义，见图1。

与脓毒症患者比较，**P<0.01。图1 血液GASL1在脓毒症、非脓毒症和健康对照者中的相对表达水平

2.3 血液LncRNA GASL1对脓毒症的诊断价值 基于血液中GASL1在脓毒症患者、非脓毒症患者和健康对照者中的表达差异，我们使用ROC曲线分析血液GASL1对脓毒症的诊断价值。相对于健康对照者，血液GASL1诊断脓毒症的曲线下面积(area under curve, AUC)是0.866，AUC的95%置信区间(confidence interval，CI)是0.831～0.902(P<0.05)，敏感度、特异度和截断值分别是0.885、0.735和1.995(图2)。相对于非脓毒症患者，血液GASL1诊断脓毒症的AUC(95%CI)、敏感度、特异度和截断值分别是0.861(0.824～0.897)、0.695、0.900和2.96。

图2 血液GASL1诊断脓毒症的ROC曲线(脓毒症vs.健康对照)

2.4 血液LncRNA GASL1在不同类型脓毒症患者中的比较

2.4.1 血液LncRNA GASL1在不同APACHEⅡ评分患者中的表达 以APACHEⅡ评分的15分为界限将134例患者分为两组，>15分和≤15分的患者分别有72例和62例，血液GASL1在APACHEⅡ>15分组和≤15分组脓毒症患者中的相对表达水平分别是(6.34±3.30)和(4.53±4.13)。两独立样本t检验分析结果表明，血液GASL1在APACHEⅡ>15分脓毒症患者中的相对表达水平显著高于APACHEⅡ≤15分脓毒症患者，P<0.01，见图3。

与>15分脓毒症患者比较，**P<0.01。图3 血液GASL1在不同APACHEⅡ评分患者中的表达水平

2.4.2 血液LncRNA GASL1在不同SOFA评分患者中的表达以SOFA评分的中位数2分为界限将134例患者分为两组，SOFA评分>7分和≤7分的患者分别有67例和67例，血液GASL1在SOFA>7分组和SOFA≤7分组脓毒症患者中的相对表达水平分别是(6.09±4.87)和(4.89±3.01)。两独立样本t检验分析结果表明，血液GASL1在SOFA>7分脓毒症患者中的相对表达水平显著高于SOFA≤7分脓毒症患者，P<0.05，见图4。

与>7分组脓毒症患者比较，*P<0.05。图4 血液GASL1在不同SOFA评分患者中的表达水平

2.4.3 血液GASL1在脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克患者中的相对表达水平 按照疾病的严重程度，将134例脓毒症患者分为脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克患者，脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克者分别有82、38和14例。血液GASL1在脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克患者中的相对表达水平分别是(4.49±3.62)、(6.58±2.65)和(7.23±6.01)。方差分析结果表明，血液GASL1在脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克患者中的相对表达水平存在显著性差异，P<0.05。两两比较显示，脓毒症患者血液中的GASL1相对表达水平显著低于严重脓毒症和脓毒症休克患者，P均<0.05。血液GASL1在严重脓毒症和脓毒性休克患者中的相对表达水平差异没有统计学意义，见图5。

与脓毒症患者比较，*P<0.05,**P<0.01。图5 血液GASL1在不同严重程度患者中的表达水平

3 讨论

GASL1是一种新发现的肿瘤抑制因子[6]。除恶性肿瘤以外，GASL1还和CHF和颅内动脉瘤相关。在CHF中，GASL1过表达可能通过抑制TGF-β1的失活抑制心肌细胞凋亡而改善CHF[7]。在颅内动脉瘤中，GASL1通过靶向TGF-β1在体外调节血管平滑肌细胞增殖[8]。除了TGF-β1以外，GASL1对Wnt/β-catenin信号通路也具有调节作用，GASL1可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而抑制胃癌患者的肿瘤生长[9]。同时TGF-β1和Wnt/β-catenin信号通路均与脓毒症及其并发症存在密切联系[10]。基于GASL1和TGF-β1、Wnt/β-catenin信号通路的关系，提示GASL1可能也和脓毒症及其相关并发症相关。本研究的分析结果显示，相对于健康对照者和ICU中的非脓毒症患者，脓毒症患者血液中GASL1表达水平升高，提示GASL1可能是脓毒症的危险因子。

脓毒症是免疫系统对损伤的一种应激反应，患者常伴随着炎症、凝血、补体和代谢等数千种内源性介质活性的变化[11]。严重脓毒症使患者的病死率增加，脓毒症导致的死亡人数约与急性心肌梗死导致的死亡人数类似[12]。及时诊断和准确划分脓毒症严重程度可以指导医师及时采取必要的治疗措施，能显著降低脓毒症死亡率[13]。目前，从无菌体液标本中检测和分离病原微生物是诊断感染和脓毒症的“金标准”[14]。然而，常规的血液培养可能需要6至5天的时间才能将一个有机体培养到可检测的水平，对脓毒症的诊治不及时。生物标记物旨在早期识别脓毒症，以便尽快对患者实施支持性措施[15]。基于血液中GASL1在脓毒症患者、非脓毒症患者和健康对照者中的表达差异，本研究使用ROC曲线分析血液GASL1对脓毒症的诊断价值。相对于健康对照者或ICU病房中的非脓毒症患者，血液GASL1均对脓毒症有较好的诊断价值(AUC>0.8)。

在所有脓毒症患者中，GASL1在APACHEⅡ或SOFA评分较高、严重脓毒症、脓毒性休克患者中表达水平较高。APACHEⅡ和SOFA是目前临床上ICU病房应用最广泛、最具权威的危重病病情评价系统[4]。APACHEⅡ和SOFA分数越高，患者的预后越差。血液GASL1在APACHEⅡ>15分/SOFA>7分脓毒症患者中的相对表达水平显著高于APACHEⅡ≤15分/SOFA≤7分脓毒症患者，提示血液GASL1可能与脓毒症患者的预后有关。严重脓毒症是指合并出现器官功能障碍表现的脓毒症。脓毒症休克是脓毒症的一个亚类，是指能显著增加患者死亡率的潜在的循环和细胞/代谢异常[17]。严重脓毒症和脓毒症休克患者的死亡率较普通脓毒症患者较高，严重脓毒症的病死率仍高达20%～50%[16]。脓毒症患者血液中的GASL1相对表达水平显著低于严重脓毒症和脓毒性休克患者，该结果进一步提示血液GASL1可能与脓毒症患者的预后有关。

综上所述，相对于健康对照者和ICU中的非脓毒症患者，脓毒症患者血液GASL1表达水平升高，提示GASL1可能是脓毒症的危险因子。且在所有脓毒症患者中，GASL1在APACHEⅡ或SOFA评分较高、严重脓毒症、脓毒性休克患者中表达水平较高。可将GASL1其作为临床诊断脓毒症及评估患者预后的指标。这对脓毒症患者的诊治具有重要意义。