刘延霞 杨 青 王红怡 林则彬 汪婧怡（海南现代妇女儿童医院儿科，海口 571100）

小儿类风湿关节炎（juvenile rheumatoid arthritis，JRA）是小儿时期常见的以关节滑膜炎症为主的全身性结缔组织病，是小儿致残的重要原因，其病因尚未完全明确［1］。滑膜成纤维细胞是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）炎性增生滑膜中的主要细胞类型，滑膜成纤维细胞活化后，其增殖、迁移及侵蚀能力增强，可侵蚀关节软骨和骨组织，导致受累关节组织结构破坏和功能障碍，因此，抑制滑膜成纤维细胞异常增殖、迁移和侵袭对防治RA 具有重要意义［2］。lncRNA 可通过影响滑膜成纤维细胞增殖、迁移及侵袭等参与类风湿关节炎发生及发展过程，研究表明LINC01419在胃癌、肺腺癌细胞中表达水平升高，抑制其表达可抑制细胞生长及转移［3-5］。然而LINC01419对小儿类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制尚不清楚。研究报道类风湿关节炎患者滑膜组织中miR-320a 的表达水平低于健康人，miR-320a 高表达可抑制滑膜成纤维细胞的增殖并促进其凋亡［6］。miR-320a上调可抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的激活、迁移和侵袭［7］。因此，本实验旨在研究LINC01419 对小儿类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制是否与miR-320a有关。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 取2017 年1 月至2019 年12 月本院收治的21 例小儿类风湿关节炎患者的滑膜组织，其中男13 例，女8 例，年龄4～13 岁；类风湿关节炎患者的诊断根据1987 年美国风湿病协会修订的标准。取21 例因骨折或创伤截肢者的膝关节正常滑膜组织作为对照，其中男14 例，女7 例，年龄5～16岁；所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 试剂 胎牛血清、DEME 培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone 公司；Trizol 试剂、cDNA 合成试剂盒、RT-qPCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公司；MTT 试剂盒、RIPA 蛋白裂解液、二辛可宁酸（BCA）试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel 购自美国BD 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分离培养JRA 滑膜成纤维细胞（RASFs）取小儿类风湿关节炎患者滑膜组织标本，用PBS 冲洗干净，无菌条件下剪碎用胰蛋白酶于37℃充分消化，200 目筛网过滤，1 000 r/min 离心5 min，离心半径10 cm，收集细胞，加入含10%胎牛血清的DEME培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养，取3～6 代细胞用于实验。

1.2.2 细胞处理与分组 将si-NC、si-LINC01419、pcDNA、pcDNA-LINC01419、miR-NC、miR-320a 转染至RASFs 中，记为si-NC 组、si-LINC01419 组、pcDNA组、pcDNA-LINC01419 组、miR-NC 组、miR-320a 组；将si-LINC01419 分别与anti-miR-NC、anti-miR-320a共转染至RASFs 中，记为si-LINC01419+anti-miRNC组、si-LINC01419+anti-miR-320a组。

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测LINC01419 和miR-320a 表达水平 提取细胞总RNA，合成cDNA，按照试剂盒说明进行PCR，PCR反应体系：2 μl 反转录产物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl 无菌水；循环条件为95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40 个循环；相对表达量用2-ΔΔCt法计算。LINC01419和miR-320a分别以GAPDH 和U6 为内参，LINC01419 正向引物序 列：5'-AGAACTGAGGTCCACTTTCTGG-3'，反 向引物序列：5'-GGTCCTTTGTCTGCAACGA-3'；GAPDH正向引物序列：5'-CATCCTGGGCTACACTGAGC-3'，反向引物序列：5'-AGTGGTCGTTGAGGGCAA-3'；miR-320a 正向引物序列：5'-GGGCTAAAAGCT⁃GGGTTGA-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCGTGTC⁃GTGGAGT-3'；U6 正向引物序列：5'-GCTTCGGCAG⁃CACATATACT-3'，反向引物序列：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 MTT 检测细胞增殖活性 在各组细胞培养至48 h 时，每孔分别加入20 μl 的MTT 溶液，继续孵育4 h，弃去上清液，加入DMSO 150 μl，振荡10 min使沉淀溶解，用酶标仪于波长490 nm 处检测吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 收集各组细胞，取200 μl接种于Transwell小室上室，培养24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下拍照并计数发生迁移的细胞数量。细胞侵袭实验在Transwell 小室上室加入50 μl 基质胶Matrigel，凝固后接种细胞，之后同细胞迁移操作。

1.2.6 Western blot 法检测CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9 蛋白表达 提取细胞总蛋白，用BCA 试剂盒定量；进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相应的一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，用Quantity One 软件测定各组蛋白条带灰度值，以目的条带和GAPDH 条带的比值作为蛋白表达水平。

1.2.7 荧光素酶报告实验检测LINC01419 和miR-320a 的靶向关系 构建LINC01419 野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-LINC01419 和MUT-LINC01419，用LipofectamineTM2000 将其分别与miR-NC 和miR-320a 共转染至RASFs 中，按照说明书检测细胞荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。细胞实验重复3 次，每组设置3 个复孔，即n=9。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜组织中的表达 与Con 组比较，RA 患者滑膜组织中LINC01419 表达水平升高，miR-320a 表达水平降低（P＜0.05），见表1。

表1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜组织中的表达（，n=21）Tab.1 Expression of LINC01419 and miR-320a in synovial tissue of JRA（，n=21）

表1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜组织中的表达（，n=21）Tab.1 Expression of LINC01419 and miR-320a in synovial tissue of JRA（，n=21）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05.

2.2 抑制LINC01419 表达对JRA 滑膜成纤维细胞增殖的影响 与si-NC 组比较，si-LINC01419 组LINC01419 表达水平降低，细胞活性降低，CyclinD1表达水平降低，p21 表达水平升高（P＜0.05），见图1和表2。

表2 抑制LINC01419 表达对JRA 滑膜成纤维细胞增殖的影响（，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表2 抑制LINC01419 表达对JRA 滑膜成纤维细胞增殖的影响（，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

图1 增殖相关蛋白表达Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.3 抑制LINC01419 表达对JRA 滑膜成纤维细胞迁移和侵袭的影响 与si-NC 组比较，si-LINC01419组迁移和侵袭细胞数降低，MMP-2、MMP-9 表达水平降低（P＜0.05），见图2和表3。

表3 抑制LINC01419 表达对JRA 滑膜成纤维细胞迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表3 抑制LINC01419 表达对JRA 滑膜成纤维细胞迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

图2 迁移和侵袭相关蛋白表达Fig.2 Expressions of migration and invasion-related proteins

2.4 LINC01419 靶向调控miR-320a 的表达 Lnc⁃Base Predicted v.2 预测显示LINC01419 的序列中含有与miR-320a互补的核苷酸序列（图3）。双荧光素酶报告实验结果显示，与miR-NC 组比较，miR-320a组转染WT-LINC01419 的细胞荧光素酶活性降低（P＜0.05），而转染MUT-LINC01419的细胞荧光素酶活性无显著变化（表4）。与pcDNA 组比较，pcDNALINC01419 组miR-320a 表达水平降低，与si-NC 组比较，si-LINC01419 组miR-320a 表达水平升高（P＜0.05，表5）。

表4 双荧光素酶报告实验（，n=9）Tab.4 Dual luciferase report experiment（，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验（，n=9）Tab.4 Dual luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

表5 LINC01419调控miR-320a的表达（，n=9）Tab.5 LINC01419 regulates expression of miR-320a（，n=9）

表5 LINC01419调控miR-320a的表达（，n=9）Tab.5 LINC01419 regulates expression of miR-320a（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

图3 LINC01419 的序列中含有与miR-320a 互补的核苷酸序列Fig.3 Sequence of LINC01419 contains a nucleotide sequence complementary to miR-320a

2.5 miR-320a 过表达对JRA 滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC 组比较，miR-320a 组miR-320a 表达水平升高，细胞活性降低，迁移和侵袭细胞数降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平降低，p21表达水平升高（P＜0.05），见图4和表6。

表6 miR-320a过表达对JRA滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.6 Effect of miR-320a overexpression on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表6 miR-320a过表达对JRA滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.6 Effect of miR-320a overexpression on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

图4 miR-320a 过表达后JRA 滑膜成纤维细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达Fig.4 Proliferation，migration and invasion related pro⁃tein expression of synovial formation in JRA after miR-320a overexpression

2.6 干扰miR-320a表达逆转了抑制LINC01419表达对JRA滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的作用与si-LINC01419+anti-miR-NC组比较，si-LINC01419+anti-miR-320a 组miR-320a 表达水平降低，细胞活性升高，迁移和侵袭细胞数升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平升高，p21表达水平降低（P＜0.05），见图5、表7。

图5 增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达Fig.5 Expressions of proteins related to proliferation，migration and invasion

表7 干扰miR-320a表达逆转了抑制LINC01419表达对JRA滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的作用（，n=9）Tab.7 Interference with miR-320a expression reversed effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表7 干扰miR-320a表达逆转了抑制LINC01419表达对JRA滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的作用（，n=9）Tab.7 Interference with miR-320a expression reversed effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-LINC01419+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

3 讨论

小儿类风湿性关节炎是儿童常见风湿性疾病，严重影响患儿身体健康。类风湿关节炎以滑膜组织增生、间质炎症细胞浸润及软骨和骨组织的破坏等为主要病理特征，研究表明成纤维样滑膜细胞的异常激活在其发生、发展中起关键作用；靶向成纤维样滑膜细胞的研究可为有效治疗RA 提供新思路［8-9］。研究报道LINC01419 在肝癌组织及其细胞系中上调表达，促进肝癌细胞的生长和迁移［10］。LINC01419 介导miR-519a-3p/PDRG1 轴，促进骨肉瘤细胞增殖及侵袭［11］。本实验结果显示，小儿类风湿关节炎患者滑膜组织中LINC01419 表达水平升高；抑制LINC01419 表达，滑膜成纤维细胞活性降低，迁移和侵袭细胞数降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表达水平降低，p21 表达水平升高；表明抑制LINC01419 表达可抑制滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭。

研究表明，miRNA 在类风湿关节炎滑膜细胞异常增殖的发生发展过程中起重要作用［12］。已有研究表明上调miR-320a 可抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的激活、迁移和侵袭［7］。还有研究报道塞来昔布治疗后膝骨关节炎患者miR-320a 表达水平升高［13］。miR-320a 的过表达可能增强白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）诱导的软骨降解因子［14］。miR-320a 通过调节软骨细胞中BMI-1 和runt相关基因2（RUNX2）的表达来预防骨关节炎软骨退化［15］。以上研究表明miR-320a 不仅影响类风湿关节炎，还影响骨关节炎的进展。此外，癌症相关的成纤维细胞中miR-320a 过表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和转移［16］。本实验结果显示，小儿类风湿关节炎患者滑膜组织中miR-320a 表达水平降低；过表达miR-320a 抑制了小儿类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭；与MENG 等［7］研究结果一致。此外，本实验还发现，LINC01419 靶向调控miR-320a的表达；且干扰miR-320a 表达逆转了抑制LINC01419表达对小儿类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

综上所述，抑制LINC01419 表达可能通过靶向上调miR-320a 抑制小儿类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭。