白静茹 白 力 庞春艳 尹芳蕊 张文兰 王永福（内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院风湿免疫科，包头医学院风湿免疫研究所，内蒙古自体免疫学重点实验室，包头 014010）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，可导致关节软骨和骨的进行性破坏，最终发展为关节畸形和功能丧失［1］。细胞因子在RA 的发病机制中发挥关键作用，可介导RA的炎症产生［2］。此外，滑膜成纤维细胞分泌的基质金属蛋白酶可导致巨噬细胞浸润软骨表面，产生血管翳，使受损关节遭到进一步破坏［3-4］。除了免疫紊乱，RA 的发病还与遗传、环境等多种因素相关［5］。目前RA 的治疗以药物为主，包括非甾体抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、改善病情抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDS）、糖皮质激素以及一些生物制剂，如TNF-α 抑制剂、IL-6 抑制剂及Janus 激酶（Janus kinase，JAK）抑制剂等［6］，但均不能完全缓解RA。

活化蛋白C（activated protein C，APC）是由其前体研究蛋白C（protein C，PC）转化而来的一种天然抗凝血剂，在凝血调控中起关键作用［7］。APC 不仅具有抗凝血作用，还具有抗炎、抗凋亡、刺激细胞增殖和屏障稳定等特性［8］。既往研究发现，APC 通过多种途径发挥细胞保护作用，绝大多数涉及APC 与内皮细胞蛋白C 受体（endothelial protein C receptor，EPCR）的结合以及蛋白酶激活受体（protease activated receptor，PAR）的裂解，从而启动下游信号通路［9-10］。在多种炎症性模型研究中，APC能够提供有效的急性或慢性治疗，并促进机体各器官的愈合和组织稳态，包括慢性创伤、严重脓毒症、脑卒中和狼疮等［11-15］。综上，本研究采用胶原诱导的关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型作为RA 疾病模型，初步探讨PC对RA的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8 周龄雄性DBA1 小鼠，体质量（20±2）g，购自中国南京生物医学研究所。

1.1.2 主要试剂与仪器 牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）、弗氏完全佐剂（CFA）购自美国Chondrex公司；GV119载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；羊抗EPCR 抗体、荧光标记抗羊IgG 抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型 采用CIA 动物模型，8 周龄雄性DBA1小鼠适应2周后，在第0天和第21天尾部皮下注射100 μl 1∶1的CⅡ和CFA 乳剂。第2次免疫后，每周对小鼠进行2次关节炎临床症状检查。四肢临床评分为0～16 分，对应四肢不同部位红肿严重程度：0 分=正常关节；1 分=趾关节轻度红肿；2 分=趾关节和足跖肿胀；3 分=趾关节至踝关节肿胀；4 分=踝关节至全部足爪肿胀［16］。对每只小鼠的四肢进行评估，单只小鼠最高分为16分。

1.2.2 PC预防性干预 为了观察PC能否预防CIA的发生，小鼠第1 次免疫后腹腔注射PC 100 μl（0.05 mg/ml），2次/周，持续3周。

1.2.3 siEPCR 腺病毒载体的构建与鉴定 合成针对Procr的siRNA靶DNA序列Procr-RNAi（77962-1）、Procr-RNAi（77963-11）、Procr-RNAi（77964-1），以及相应阴性对照序列，引物退火形成双链DNA。利用AgeⅠ、EcoRⅠ酶切GV119 载体，酶切后的载体与退火产物通过T4 DNA ligase 进行连接反应，产物添加至TOP10 感受态细胞转化后进行菌落PCR 鉴定，将鉴定出的阳性克隆转化子测序，测序正确的菌液进行质粒抽提。针对Procr 基因构建过表达载体并鉴定，将Procr 过表达载体与siProcr 干扰载体共转染293T细胞，Western blot检测基因敲减情况。

1.2.4 PC 发病后干预及siEPCR 腺病毒载体干预 为了观察PC 能否缓解CIA 的发展，小鼠第2 次免疫后第2周开始腹腔注射PC 100 μl（0.05 mg/ml），2 次/周，持续3 周。为明确PC 是否通过EPCR 发挥作用，PC 干预前24 h 腹腔注射siEPCR 腺病毒载体100 μl，1次/周，以EPCR空载体作为同型对照。

1.2.5 关节炎的组织病理学和关节肿胀度评估针对PC 预防性干预的CIA 小鼠，在第2 次免疫后的第28天处死小鼠，从小鼠后肢取关节，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋（5 μm），Micro-CT、HE 染色、甲苯胺蓝染色。针对PC发病后干预的CIA小鼠，在第2次免疫后的第70天处死小鼠，方法同前，Micro-CT、HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O 染色。关节评分如1.2.1所述。

1.2.6 免疫荧光染色检测EPCR 表达 分离CIA小鼠和DBA1 小鼠滑膜组织进行石蜡包埋切片，用羊抗EPCR抗体和荧光标记抗羊IgG抗体进行检测，在荧光显微镜下观察组织切片。

2 结果

2.1 PC 预防性干预可降低CIA 小鼠的关节炎发生率及疾病严重程度 第2 次免疫后的第7 天到第28天对小鼠进行关节炎临床症状检查及评分，经PC 干预的CIA 小鼠的临床评分显著降低，足爪肿胀程度明显减轻（图1A、B）。Micro-CT 结果显示，CIA模型组小鼠骨破坏、关节肿胀严重，而PC干预组小鼠相对轻微（图1C）。HE 染色和甲苯胺蓝染色结果显示，PC干预组关节间隙变窄、滑膜炎症细胞浸润、软骨蛋白多糖损失、软骨侵蚀等情况明显缓解（图2）。

图1 PC干预后各组小鼠关节炎评分、关节外形及Micro-CTFig.1 Arthritis score，joint shape and Micro-CT of mice in each group after PC intervention

图2 PC干预后各组小鼠关节组织病理形态改变（×20）Fig.2 Pathological morphological changes of joint tissues of mice in each group after PC intervention（×20）

2.2 EPCR 在小鼠滑膜组织中的表达情况 免疫荧光切片检测小鼠滑膜组织中EPCR 的表达。结果显示，在CIA 小鼠和DBA1 小鼠的关节滑膜组织中存在显著的EPCR 表达，且CIA 小鼠EPCR 表达明显低于DBA1对照组（图3）。

图3 EPCR在CIA小鼠和DBA1小鼠滑膜组织中的表达Fig.3 Expressions of EPCR in synovial tissue of CIA and DBA1 mice

2.3 siEPCR腺病毒载体的构建与鉴定结果 Procr-RNAi（77964-1）靶点对目的基因的表达有敲减作用，因而是有效靶点（图4）。

2.4 siEPCR 逆转PC 的保护作用 与CIA 模型组相比，PC+空载体干预组小鼠临床评分降低，关节炎症状得到缓解，而PC+siEPCR 腺病毒载体干预组小鼠无明显治疗效果，足肿胀仍较为严重（图5A、B）。Micro-CT 结果显示，与CIA 模型组相比，PC+空载体干预组小鼠的骨侵蚀、关节肿胀减轻，而PC+siEPCR腺病毒载体干预组小鼠仍表现为明显的关节膨大、关节间隙缩窄（图5C）。HE 染色、甲苯胺蓝染色、番红O 染色结果显示，PC+siEPCR 腺病毒载体干预组小鼠有明显的关节面破坏、滑膜炎症细胞浸润、基质蛋白多糖损失（图6）。提示siEPCR 可逆转PC 的保护作用。

图5 PC+siEPCR 干预后各组小鼠关节炎评分、关节外形及Micro-CTFig.5 Arthritis score，joint shape and Micro-CT of mice in each group after PC+siEPCR intervention

图6 PC+siEPCR 干预后各组小鼠关节组织病理形态改变（×20）Fig.6 Pathological morphological changes of joint tissues of mice in each group after PC+siEPCR interven⁃tion（×20）

3 讨论

既往研究表明，PC在炎症性模型中能提供有效的急性或慢性治疗［11］。2001 年的研究发现，重组人APC（rhAPC）治疗可显著降低严重脓毒症患者的病死率，因此FDA 批准rhAPC 进入临床［17］，但后续研究发现，rhAPC 无法降低严重脓毒血症患者的死亡风险，相反，证实rhAPC 治疗会增加出血性副作用，rhAPC 在脓毒血症患者中的疗效因此受到质疑，最终rhAPC 退出市场［18］。随着APC 作为一种抗菌剂的重新上市，人们开始关注其抗凝以外的其他作用，包括抗炎、抗凋亡、细胞保护作用等。本研究应用CIA 小鼠预防性给予PC，结果显示PC 治疗可有效降低关节炎发生率及疾病严重程度。发病后干预同样可延缓关节炎发展，但治疗效果较发病前干预差。

EPCR 是一种跨膜糖蛋白，在内皮细胞等多种细胞类型中均有表达，研究发现EPCR 促进PC 向APC 转化，在抗凝途径中发挥作用，并作为APC 裂解PAR 的共受体，参与其诱导的细胞保护信号传递［19-20］。APC-EPCR已被证实在炎症性肠病、缺血性脑卒中、糖尿病肾病等各种炎症性疾病及自身免疫性疾病中发挥作用［21-23］。有研究发现，EPCR 在RA和骨关节炎患者滑膜组织中存在异常表达，且在CIA 小鼠滑膜组织中检测到了EPCR 表达［24-26］。与预期一致，本研究发现EPCR 在CIA 小鼠和DBA1小鼠的关节滑膜组织中显著表达，且CIA 小鼠EPCR表达明显低于DBA1 对照组。为了验证EPCR 在PC治疗中的意义，本研究采用siEPCR 腺病毒载体干预CIA 小鼠，下调EPCR 表达，siEPCR 逆转了PC 的保护作用，CIA 小鼠的关节炎症状未能得到有效缓解。因此推测PC 可能通过EPCR 在CIA 中发挥作用，发病后干预治疗效果较发病前干预差，可能与EPCR表达差异有关。

综上所述，PC干预可缓解CIA疾病进展，而EPCR是PC发挥作用的通路依赖蛋白。在未来的研究中，可通过PC 靶向滑膜成纤维细胞、T 细胞等进行进一步分析，对PC-EPCR 下游信号机制更深入的了解可能会为治疗RA提供新的见解。